Thermo Fisher Scientific LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit 取扱説明書

ブランド: Thermo Fisher Scientific

モデル: LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit

タイプ: 取扱説明書

MP 03224 LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit*

製品情報

2005

年

月

日改

訂

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*

はじめに

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Assay Kit は、2種類のプ

ローブによる生細胞と死細胞の同時判定に基づく 2色蛍光の

細胞生存アッセイです。これらのプローブは、よく知られた

細胞生存のパラメータである細胞内エステラーゼ活性と原形

質膜の完全性を測定します。Molecular Probes により、カル

セイン AM とエチジウムホモダイマー1（EthD-1）が、この

アプリケーションに最適の色素であることが明らかにされて

います 1-3。本キットは蛍光顕微鏡または蛍光マルチウェル

プレートスキャナーでの使用に適しており、フローサイトメ

トリーなどの蛍光検出システムでの使用に容易に適合させる

ことが可能です。アッセイの原理は普遍的なものであり、接

着細胞 4および特定の組織 5,6 などほとんどの種類の真核細胞

に適用可能ですが、細菌や酵母には使用できません 3。この

ような蛍光をベースにした細胞生存評価法は、トリパンブル

ー色素排除試験、51 クロム（Cr）放出試験など、生細胞およ

び細胞傷害性を判定する手法の代わりに用いることができま

す。一般に、本キットは、細胞毒性イベントの検出法として、

代替法よりも迅速、安価、安全、高感度です。動物細胞アプ

リケーションに対する LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity ア

ッセイの妥当性が複数の研究室で立証されています。発表済

みのアプリケーションとしては、腫瘍壊死因子（TNF）の細

胞毒性作用 7、β-アミロイドタンパク質 8、アデノウイルス

E1A タンパク質 9、Na＋チャンネルに結合するテトロドトキ

シン（TTX）10、メタアンフェタミン 11、有糸分裂促進性ス

フィンゴ脂質 12 の測定が挙げられます。また、本アッセイ法

は、アポトーシス細胞死 13,14 および細胞介在性細胞毒性 15,16

の定量にも用いられています。

本法の原理

生細胞の識別は、遍在する細胞内エステラーゼ活性の有無

に基づきます。定量は、ほぼ非蛍光である細胞膜透過性カル

セイン AM を、強い蛍光を発するカルセインに変換する酵

素活性を測定します。多価イオン性色素であるカルセインは

生細胞内に良好に保持されるため、生細胞で強く均一な緑色

蛍光を発します（ex/em：約 495 nm/515 nm）。一方 EthD-1

は膜が損傷した細胞に入り、核酸に結合することにより蛍光

が約 40 倍に増強されるため、死細胞で明るい赤色蛍光を発

します（ex/em 約495 nm/635 nm）。EthD-1 は生細胞の無傷

な原形質膜では排除されます。細胞生存の判定は、このよう

な細胞の物理的および生化学的特性に基づいています。その

ため、これらの細胞特性に影響を及ぼさない細胞毒性イベン

トは、この手法では正確に評価できない可能性があります。

これらの色素は細胞と相互作用する前はほぼ非蛍光であるた

め、このアッセイ技術ではバックグラウンド蛍光強度がかな

り低く抑えられています。

キットの内容

y カルセイン AM（Component A）、バイアル 2本にそれぞ

れ40 μL、4 mM の無水 DMSO 溶液

y エチジウムホモダイマー1（Component B）、バイアル 2

本にそれぞれ 200 μL、2 mM の1:4 (v/v) DMSO/H2O溶液

本キットは、推奨試薬濃度および用量で、蛍光顕微鏡また

は蛍光マイクロプレートリーダーを用いて約 1,000 回のアッ

セイ、またはフローサイトメトリーを用いて約 100 回のアッ

セイを実施するのに十分な量の成分を含有しています。

試薬の保管および取り扱い

本キットの試薬は、密閉、乾燥、遮光条件下で、-20℃以

下で凍結保存します。開封前に試薬を室温になるまで静置し

て、軽く遠心分離します。再凍結前に、ストック溶液はすべ

てしっかりと密封します。カルセイン AM は水分に触れる

と加水分解しやすくなります。カルセイン AM を含有する

ワーキング溶液は使用直前に調製し、その日のうちに使用し

てください。EthD-1 は安定であり、水分に対する感受性は

ありません。DMSO/H2Oまたはその他の水性溶媒中の EthD-

1ストック溶液は、-20℃以下で 1年以上保存可能です。

受領時の保管条件

y -20˚C以下

y 遮光

Ex/Em

y カルセイン＝494/517 nm

y DNA 存在下でのエチジウムホモダイマー1＝

528/617 nm

注：

カルセイン AM は水分に触れると加水分

解することがあります。

ひとこと

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit* 2

蛍光顕微鏡のプロトコール

光学フィルターの選択

カルセインおよび EthD-1 は、汎用のフルオレセインロン

グパスフィルターにより同時に観察できます。これらの色素

由来の蛍光を別々に観察することも可能です。カルセインは、

標準的蛍光色素バンドパスフィルターで可視化され、EthD-1

はPropidium iodide または Texas Red®色素で可視化されます。

適切なフィルターの一般的特性を表 1に要約しています。

細胞の調製

1.1 接着細胞は、コンフルエントまたはサブコンフルエン

トな単層として滅菌カバーガラス上で培養します（例、線維

芽細胞は通常、2～3日間カバーガラス上で増殖すると、許

容可能な細胞密度が得られます）。その細胞を 35 mm の使

い捨てペトリ皿など、適切な容器中で培養します。また非接

着細胞も使用可能です。

1.2 アッセイ前に細胞を洗浄し、血清含有培地中に存在す

る血清由来のエステラーゼ活性を除去または希釈します（血

清エステラーゼによりカルセイン AM が加水分解されるこ

とにより細胞外蛍光を増強させることがあります）。接着細

胞を、500～1,000 倍量のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水

（D-PBS）により穏やかに洗浄します（注 A）。

1.3 試験管内の非接着細胞を 500～1,000 倍量の組織培養等

級D-PBS で洗浄し、遠心分離により沈降させます。細胞上

清のアリコートをカバーガラスに移します。蓋をした 35

mm のペトリ皿内で、37℃でカバーガラスの表面に細胞を定

着させます。

1.4 この細胞を、LIVE/DEAD®試薬浸漬前の任意の時点ま

たは浸漬と同時に、必要に応じて細胞毒性剤により処理しま

す。

色素の最適濃度の決定

最良の結果を得るためには、カルセイン AM により生細

胞が、EthD-1 により死細胞が明確に標識されるように各色

素の濃度を調整する必要があります。最適濃度は細胞型によ

り異なると考えられます。一般に、十分なシグナルが得られ

る最低濃度の色素を用いるのが理想的です。以下の手法を用

いて、色素の最適濃度を決定することができます。

2.1 LIVE/DEAD®アッセイ用試薬を冷凍庫から取り出し、

室温になるまで静置します。

表1. LIVE/DEAD®Viability Kitの使用に適した一般的フィル

ターの特性

オメガ

フィルター*

クロマ

フィルター*注

XF25, XF26,

XF115 11001, 41012,

71010 カルセインおよび EthD-1

染色の同時観察に有用なロ

ングパスおよびデュアル発

光フィルター

XF22, XF23 31001, 41001 カルセインのみを観察でき

るバンドパスフィルター

XF32, XF43,

XF102, XF108 31002, 31004,

41002, 41004 EthD-1 のみを観察できるバ

ンドパスフィルター

*蛍光顕微鏡用に推奨されるバンドパスフィルターセットのカタログ

番号。オメガフィルターは Omega Optical Inc.

（www.omegafilters.com）が販売しています。クロマフィルターは

Chroma Technology Corp.（www.chroma.com）が販売していま

す。

2.2 生細胞と死細胞のサンプルをカバーガラス上に調製し

ます。細胞は以下のいずれかの方法で殺処理します（例、

0.1%サポニンで 10 分間処理、0.1～0.5%ジギトニンで 10 分

間処理、70%メタノールで 30 分間、補体および適切な IgG

で30 分間）。

2.3 死細胞サンプルを用いて、細胞質を大きく染色するこ

となく死細胞核を明るい赤に染色する EthD-1 濃度を選択し

ます（0.1～10 μMの濃度をお試しください）。

2.4 死細胞サンプルを用いて、死細胞の細胞質に顕著な蛍

光を生じないカルセイン AM 濃度を選択します（0.1～10 μM

の濃度をお試しください）。

2.5 生細胞サンプルを用いて、ステップ 2.4 で選択したカル

セイン AM 濃度が生細胞で十分な蛍光シグナルを発するこ

とを確認します（十分でなかった場合、高い濃度をお試しく

ださい）。

2.6 ステップ 2.3 および 2.5 で決定した試薬濃度が生存実験

に最適な濃度となります。

希釈プロトコールの例

このプロトコール例では、約 2 μMのカルセイン AM 溶液

および約 4 μMのEthD-1 溶液を 10 mL 調製します。これら

の色素の濃度は、室温で 20～40 分間インキュベートする場

合に、NIH 3T3 細胞、PtK2 細胞、MDCK 細胞に適している

ことが明らかになっています。培養マウス白血球

（J774A.1）はエステラーゼ活性が高いため、カルセイン

AM の必要量は他の細胞型の 1/5～1/10 で済みます。ただし、

EthD-1 の必要量に変更はありません。これはあくまでも一

例であり、実際の実験では最適な色素濃度は異なります。

3.1 LIVE/DEAD®アッセイ用試薬を冷凍庫から取り出し、

室温になるまで静置します。

3.2 2 mM EthD-1 ストック溶液（Component B）20 μLを、

滅菌済みの組織培養グレードの D-PBS 10 mL に添加し、ボ

ルテックスにかけて完全に混合します。これにより、約 4

μMのEthD-1 溶液が得られます。

3.3 4 mM カルセイン AM ストック溶液（Component A）5

μLをEthD-1 溶液 10 mL に移すことにより、試薬を合わせま

す。得られた溶液をボルテックスにかけて、完全に混合しま

す。

3.4 カルセイン AM を約 2 μMおよび EthD-1 を約 4 μMを

含有するワーキング溶液を細胞に直接添加します。DMSO

の最終濃度は 0.1%以下であり、大部分の細胞にとって通常

は無害なレベルとなります。

3.5 カルセイン AM 水溶液は加水分解しやすいことにご注

意ください（「試薬の保管および取り扱い」参照）。したが

って、使用水溶液はその日のうちに使用してください。

生存アッセイの実施

4.1 混合した LIVE/DEAD®アッセイ用試薬 100～150 μLを、

最適濃度で、22 mm の角形カバーガラス表面に添加し、細胞

が溶液で覆われるようにします。蓋をした容器（例、35 mm

の使い捨てペトリ皿）の中でインキュベートし、サンプルの

コンタミネーションや乾燥を防止します。

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit* 3

4.2 この細胞を室温で 30～45 分間インキュベートします。

色素濃度やインキュベーション温度を上昇させると、インキ

ュベート時間を短くできます。

4.3 インキュベーション後、約 10 μLの新鮮な

LIVE/DEAD®試薬または約 10 μLのD-PBS を、清浄な顕微鏡

用スライドに添加します。

4.4 濡らしたカバーガラスを、先端が細い鉗子を用いて慎

重（かつ迅速）にひっくり返し、顕微鏡用スライドの上に乗

せます。蒸発を防ぐため、カバーガラスをガラススライドに

密閉します（例、透明なマニキュアを使用）。スライド調製

中に細胞を傷つけたり、破砕したりしないように注意します。

4.5 標識した細胞を蛍光顕微鏡下で観察します。

蛍光マイクロプレートプロトコール

マイクロプレートリーダー用の光学フィルターの選定

プレートリーダーを用いて最大の感度を得るために、それ

ぞれの吸光度に最適な光学フィルターを用いてフルオロフォ

アを励起させることを推奨します。カルセインを十分に励起

するには蛍光色素光学フィルター（485±10 nm）を使用しま

すが、EthD-1 は一般的なローダミン光学フィルター

（530±12.5 nm）と互換性があります。また、蛍光発光も、

カルセインについては 530 ±12.5 nm、EthD-1 については

645±20 nm で別々に取得します。

マイクロプレートリーダー用に細胞を調製する

5.1 マルチウェルプレートで接着細胞を培養します。線維

芽細胞は一般に、ウェル内で 2～3日増殖させると、良好な

細胞密度が得られます。アッセイ前に、細胞を、500～1,000

倍量のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で穏やか

に洗浄します（注 A）。最後の洗浄の後、D-PBS をウェルの

底を覆うのに十分な量添加します。細胞サンプルを洗浄し、

エステラーゼ活性を除去または希釈します。エステラーゼ活

性は、血清含有培地に通常存在するものであり、カルセイン

AM の加水分解により細胞外蛍光が増強される場合がありま

す。

5.2 比較的接着性の低い細胞（例、白血球またはその他の

浮遊細胞）を、試験管内で、500～1,000 倍量の組織培養グレ

ードの D-PBS で洗浄し、遠心分離により沈降させて血清由

来エステラーゼ活性を除去します。

5.3 この細胞を十分な量の緩衝液中に懸濁し、ウェルの底

を十分に覆う量を添加します。一般に、総容量が 250～

300 μLの平底のウェルについては、約 100 μLを添加します。

総容量が 150～200 μLの丸底のウェルについては、約 70 μL

を添加します。総容量が 100～150 μLのコニカルウェルにつ

いては、約 50 μLを添加します。細胞毒性剤などの試薬の希

釈を最小限にするためには、少量の緩衝液が好まれる場合が

あります。

5.4 その細胞を、LIVE/DEAD®試薬染色前の任意の時点で、

または同時に、必要に応じて細胞毒性剤により処理します。

5.5 1ウェルあたりの検出可能な最少の細胞数は通常、200

～500 個です。1ウェルあたりの使用可能な最大の細胞数は、

106単位です。

最適な色素濃度の決定

最良の結果を得るためには、カルセイン AM により生細

胞が、EthD-1 により死細胞が明確に染色されるように各色

素の濃度を調整する必要があります。光学フィルター、装置

の感度設定、細胞の数または種類を変更した場合、色素濃度

も変更する必要になる場合があります。一般に、十分なシグ

ナルが得られる最低濃度の色素を用いるのが理想的です。以

下の手法を用いて、色素の最適濃度を決定することができま

す。

6.1 LIVE/DEAD®試薬を冷凍庫から取り出し、室温になる

まで静置します。プレートリーダーに適切なフィルターを選

択し、適切に設定します。

6.2 生細胞と死細胞のサンプルを調製します。細胞はいず

れかの方法で殺処理します（例、0.1%サポニンで 10 分間処

理、0.1～0.5%ジギトニンで 10 分間処理、70%メタノールで

30 分間、補体および適切な IgG で30 分間）。

6.3 死細胞サンプルを用いて、EthD-1 の飽和濃度（最大の

蛍光を発する最低濃度）を決定します。細胞濃度を高く維持

しながら（1 mL あたり約 106個）、EthD-1 の濃度 0.1～10

μMをお試しください。最適なインキュベーション時間を決

定するために染色を経時的に観察します（例えば、10～15

分おきに測定値を取ります）。当社では、4 μM EthD-1 で45

分間インキュベートすることにより、120,000 個のマウス死

白血球サンプルの結合部位が飽和されることが明らかになっ

ています。

6.4 死細胞サンプルを用いて、死細胞がごくわずかにしか

染色されないカルセイン AM 濃度を決定します（濃度 0.1～

5 μMをお試しください）。

6.5 生細胞サンプルを用いて、生細胞にはっきりと検出で

きる蛍光が認められるカルセイン AM 濃度を決定します。

シグナルが低すぎる場合、細胞数を増やすか、色素の濃度を

若干高くします。

6.6 ステップ 6.3 および 6.5 で決定した試薬濃度が生存アッ

セイに最適な濃度となります。

マイクロプレートリーダー測定用のサンプル調製例

このプロトコール例では、マルチウェルプレートスキャナ

ーで用いる、カルセイン AM 1 μMおよび EthD-1 2 μMの

LIVE/DEAD®試薬を 10 mL 調製します（当社テストでは、こ

れらの試薬濃度がマウス白血球に最適であること明らかにな

っています）。本プロトコールでは、2倍濃縮試薬ストック

液を調製し、これをウェルに添加することで、最終濃度が 2

倍希釈となるようにします。1ウェルに用いる容量を 100 μL

とすると、ストック液が 10 mL あれば、96 ウェルマイクロ

プレート 1枚に十分足りる染色液が得られます。これはあく

までもプロトコールの一例に過ぎません。実験で用いられる

実際の容量および濃度は、用いられる細胞とマイクロプレー

トの種類によって異なります。

7.1 LIVE/DEAD®試薬のストック液を冷凍庫から取り出し、

室温になるまで温めます。

7.2 2 mM EthD-1 ストック溶液（Component B）20 μLを、

滅菌済みの組織培養グレードの D-PBS 10 mL に添加し、ボ

ルテックスにかけて完全に混合します。これにより、約 4

μMのEthD-1 溶液が得られます。

7.3 4 mM カルセイン AM のDMSO 溶液（Component A）

5 μLを4 μM EthD-1 溶液 10 mL に移します。得られた溶液を

ボルテックスまたは超音波にかけて、完全に混合します。こ

れにより、カルセイン AM が約 2 μM、EthD-1 が約 4 μMの

ワーキング溶液が得られます。

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit* 4

7.4 各ウェルに細胞含有緩衝液を 100 μLずつ分注します。

さらに、LIVE/DEAD®ワーキング溶液 100 μLを添加すると、

1ウェルあたり 200 μLとなり、カルセイン AM を1 μMおよ

びEthD-1 を2 μM含有する溶液が得られます。DMSO の最

終濃度は 0.1%以下であり、大部分の細胞にとって通常は無

害なレベルとなります。

マイクロプレートリーダーを用いた蛍光測定

8.1 実験用細胞のサンプル（以下の Aおよび B）および生

細胞と死細胞の対照（以下の C～F）を調製します。

8.2 バックグラウンド蛍光の発生源に配慮して、一連の対

照についても測定します。バックグラウンド蛍光は、のちほ

ど計算により除外できます。被験細胞サンプルと対照細胞サ

ンプルを同じ要領で処理します（すなわち、細胞数、試薬濃

度、インキュベーション時間および温度を一定に維持しま

す）。被験細胞をカルセイン AM および EthD-1 で標識しま

す。対照サンプルをカルセイン AM または EthD-1 のいずれ

かで、指示どおりに標識します。試験を行う細胞毒性物質ま

たは培地中の他の添加物質由来のバックグラウンド蛍光を確

認する場合は、細胞を含有しない対照（以下の Gおよび

H）を測定しても構いません。

8.3 LIVE/DEAD®試薬を最適な最終濃度になるようにウェ

ルに添加します（

「最適な色素濃度の決定」

の項に記載）。

8.4 このサンプルを最適な時間インキュベートします

（

「最適な色素濃度の決定」

の項に記載）。例、室温で 30

～45 分間。

8.5 適切な励起フィルターと発光学フィルターを用いて被

験細胞サンプルと対照細胞サンプルの蛍光を測定します。

A. カルセイン AM とEthD-1 で標識した被験細胞サンプル

における 645 nm での蛍光＝F (645)sam

B. カルセイン AM とEthD-1 で標識した被験細胞サンプル

における 530 nm での蛍光＝F (530)sam

C. EthD-1 のみで標識した死細胞のみのサンプルにおける

645 nm での蛍光＝F (645)max

D. カルセイン AM のみで標識した死細胞のみのサンプル

における 645 nm での蛍光＝F (645)min

E. EthD-1 のみで標識した（ほぼ）生細胞のみのサンプル

における 530 nm での蛍光＝F (530)min

F. カルセイン AM のみで標識した（ほぼ）生細胞のみのサ

ンプルにおける 530 nm での蛍光＝F (530)max

G. 色素添加の有無にかかわらず、細胞を含有していない

サンプルにおける 530 nm での蛍光＝F (530)0

H. 色素添加の有無にかかわらず、細胞を含有していない

サンプルにおける 645 nm での蛍光＝F (645)0

結果の解釈

生細胞と死細胞の相対数は、約 530 nm とそれより長波長

の特定の蛍光シグナル（

「生細胞と死細胞の絶対数の決定」

の項に記載）における細胞の割合または絶対数から表すこと

が可能です。死細胞は、波長 600 nm 超で強い蛍光を示し、

530 nm 付近でほとんど蛍光を示さないという特徴がありま

す。結果の算出前に、バックグラウンド蛍光値（F (530)0と

F (645)0）を F (530) および F (645) の全値からそれぞれ差し

引くことができます。

生細胞の割合は、上に定義する蛍光値から算出できます。

%生細胞＝F (530)sam – F (530)min

F (530)max – F (530)min × 100%

死細胞の割合は、上に定義する蛍光値から算出できます。

%死細胞＝F (645)sam – F (645)min

F (645)max – F (645)min × 100%

マイクロプレートリーダーを用いた生細胞と死細胞の絶対

数の決定

サンプル中の総細胞数は、細胞をすべて殺処理し（ステッ

プ6.2）、飽和濃度の EthD-1 で標識し、600 nm 超で蛍光を

測定することにより計数できます。これにより、蛍光強度は、

サンプル中に存在する総細胞数に対して直線性を示します。

この操作を一連の生存実験の最後に行い、生細胞と死細胞の

絶対数により細胞生存度を表すことができます。

9.1 細胞生存測定を実施します（

「マイクロプレートリー

ダーを用いた蛍光測定」

の項に記載）。

9.2 サンプル中の細胞をすべて殺処理します（例、0.1%サ

ポニンを各ウェルに添加。5%サポニン蒸留水ストック溶液

から 1ウェルあたり 2～5 μLを添加する）。

9.3 プレートを振とうして混合します。10 分間（またはシ

グナルが平衡に達するまで）待ちます。

9.4 645 nm 付近の EthD-1 蛍光を読み取ります。蛍光強度は、

サンプル中の細胞数と線形相関を示します。この値は、死細

胞数対蛍光強度の標準曲線と比較可能です。この標準曲線は、

マイクロプレート中の既知数の死細胞に対する飽和 EthD-1

濃度を用いて別途作成します。

フローサイトメトリーのプロトコール：

生存アッセイ

10.1 各試薬を室温になるまで静置します。

10.2 カルセイン AM（Component A）DMSO 溶液の 80 倍希

釈液を作成し、50 μMのワーキング溶液を作成します（すな

わち、158 μLのDMSO にComponent A を2 μL添加）。この

ワーキング溶液はその日のうちに使用してください。

10.3 アッセイ 1回につき 0.1～5×106個/mL の浮遊細胞を

1 mL 調製します。培養液と緩衝液のいずれを使用しても構

いません。

10.4 細胞1 mL あたり、50 μMカルセイン AM ワーキング

溶液を 2 μLおよび 2 mM エチジウムホモダイマー1ストック

液4 μLを添加し、これを混合します。

10.5 この細胞を室温で遮光し、15～20 分間インキュベート

します。

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit* 5

10.6 インキュベーション（1～2時間以内）後できるだけ早

く、488 nm の励起光を用いたフローサイトメトリーにより

染色細胞を解析し、カルセインについては緑色の蛍光発光

（すなわち、530/30 バンドパス）を、エチジウムホモダイマ

ー1については赤色の蛍光発光（すなわち、610/20 バンドパ

ス）を測定します。細胞をゲーティングすることにより、デ

ブリを除去します。単染色細胞を用いて、標準的な補正を実

施します。細胞集団は 2つに分離し、生細胞は緑色蛍光を示

し、死細胞は赤色蛍光を示します（図 1）。

フローサイトメトリーのプロトコール：

CountBright

™細胞絶対数計数用ビーズによる生

存アッセイ

注：CountBright™細胞絶対数計数用ビーズによる細胞計数の

精度は、サンプルの取り扱いおよび正確なビーズ量の送出に

左右されます。CountBright™細胞絶対数計数用ビーズは、十

分に混合して、マイクロスフィアが均一な懸濁液とします。

アリコートを取る直前にボルテックスに 30 秒間かけます。

細胞懸濁液は希釈しても構いませんが、アッセイは洗浄ステ

ップを行わずに実施してください。

11.1 各試薬を完全に溶けるまで静置します。

11.2 カルセイン AM（Component A）DMSO 溶液の 80 倍希

釈液を作成し、50 μMの使用液を作成します（すなわち、

158 μLのDMSO にComponent A を2 μL添加）。この使用液

はその日のうちに使用してください。

11.3 アッセイ 1回につき 0.1～5×106個/mL の浮遊細胞を

1 mL 調製します。培養液と緩衝液のいずれを使用しても構

いません。

11.4 細胞 1 mL あたり、50 μMカルセイン AM ワーキング

溶液を 2 μLおよび 2 mM エチジウムホモダイマー1ストック

液4 μLを添加し、これを混合します。

11.5 この細胞を室温で遮光し、15～20 分間インキュベート

します。

11.6 CountBright™細胞絶対数計数用ビーズを室温になるま

で静置します。このマイクロスフィア懸濁液を 30 秒間穏や

かにボルテックスにかけ、完全に再懸濁します。

11.7 この計数用ビーズ懸濁液のボルテックス直後に、サン

プル 1 mL につき計数用ビーズ 50 μLを添加し、ボルテック

スにかけます。

注：この希釈濃度で、CountBright™細胞絶対数計数用ビーズ

に添加された少量の Tween20 とアジ化ナトリウムが細胞の

染色または生存に影響を及ぼすという報告はありません。

11.8 インキュベーション（1～2時間以内）後できるだけ早

く、488 nm の励起光を用いたフローサイトメトリーにより

染色細胞を解析し、カルセインについては緑色の蛍光発光

（すなわち、530/30 バンドパス）を、エチジウムホモダイマ

ー1については赤色の蛍光発光（すなわち、610/20 バンドパ

ス）を測定します。細胞（デブリ除去のため）および計数用

ビーズの両者をゲーティングします。前方散乱閾値は低い値

に設定し、前方散乱対側方散乱のプロットにこのマイクロス

フィアが含まれるようにします（図 2）。単染色細胞を用い

て、標準的な補正を実施します。細胞集団は 2つに分離し、

生細胞は緑色蛍光を示し、死細胞は赤色蛍光を示します。

CountBright™細胞絶対数計数用ビーズは細胞と区別できます

（図 3）。

図1. LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kitを用いたフローサイトメ

トリーによる生存アッセイ。ヒト B細胞の生細胞および死細胞（エ

タノールで固定）を 1：1の割合で混合し、本プロトコールに従って、

カルセイン AM およびエチジウムホモダイマー1で染色します。フロ

ーサイトメトリー解析を 488 nmの励起光により実施します。その結

果、二変量度数分布が得られ、緑色蛍光（530 nm）の生細胞集団と

赤色蛍光（585 nm）の死細胞集団の明確な分離が示されています。

注：サンプル量を統計学的に有意に定量できるように、

1,000 以上のビーズイベントを採取します。

11.9 計数用ビーズは全蛍光プロットの上右隅に示されてい

るため（図 3）、ゲーティングが可能です。

注：発光パラメータの特定の組み合わせでは CountBright™

細胞絶対数計数用ビーズと細胞とを区別できない場合、計数

用ビーズをゲーティングできるように発光パラメータの組み

合わせの変更を試みてください。

細胞濃度の算出：

B × C

D ＝サンプル濃度、細胞数/μL

ここで、

A＝細胞イベント数

B＝ビーズイベント数

C＝ロットに割り付けられたビーズ数（ビーズ数/50 μL）

D＝サンプル量（μL）

計算例：細胞 1,000 μLを染色しました。その後、

CountBright™細胞絶対数計数用ビーズ 50 μLを添加しました。

ビーズ

個の細胞

1,030

700,1

× 49,500ビーズ/50 μL

1,000μL = 81.7 個の細胞/μL

注：この計算は、サンプルを希釈している場合、または異な

る容量の CountBright™細胞絶対数計数用ビーズを用いてい

る場合には補正する必要があります。

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit* 6

図2. 前方散乱対側方散乱で、ゲーティングしたビーズの計数。ジ

ャーカット細胞（ヒト T細胞白血病）の生細胞と死細胞（加熱によ

り殺処理）の混合物を、本プロトコールに従って、カルセイン AM

とエチジウムホモダイマー1で染色しました。フローサイトメトリー

でのデータ取得前に CountBright™細胞絶対数計数用ビーズを添加し

ました。A）前方散乱対対数側方散乱で、デブリ除去のための細胞の

ゲーティングと計数用ビーズのゲーティングが示されています。B）

前方散乱対線形側方散乱で、細胞のゲーティングによるデブリの除

去と計数用ビーズのゲーティングが示されています。計数用ビーズ

のゲーティングは側方散乱に最終チャンネルが含まれるように調整

します。

図3. 530/30 バンドパスフィルターを通して収集されたカルセイン

蛍光のプロットと、610/20 バンドパスフィルターを通して収集され

たエチジウムホモダイマー1蛍光のプロット。生細胞と死細胞、およ

び計数用ビーズが明確に分離しています。ジャーカット細胞の生細

胞と死細胞（加熱により殺処理）の混合物を、本プロトコールに従

って、カルセイン AM とエチジウムホモダイマー1で染色しました。

488 nm の励起光を用いたフローサイトメトリーでのデータ取得の前

にCountBright™細胞絶対数計数用ビーズを添加しました。

注

［A］本プロトコールでは標準的な生理食塩緩衝液を用いる

ことができます。ただし、フェノールレッドのような着色添

加物は、蛍光に影響を及ぼすかどうかを確認する必要があり

ます（ステップ 8.2 を参照）。推奨される緩衝液は滅菌済み

組織培養等級 D-PBS です。組成は、KCl（200 mg/L）、

KH2PO4（200 mg/L ）、NaCl （8,000 mg/L ）、Na2HPO4

（1,150 mg/L）です。

参考文献

1. Principles and Methods of Toxicology, Third Edition, A.W. Hayes, Ed., Raven Press (1994) pp. 1231–1258; 2. J Immunol Methods 177, 101 (1994);

3. J Microbiol Methods 17, 1 (1993); 4. J Neurosci 15, 5389 (1995); 5. J Cell Sci 106, 685 (1993); 6. Pflügers Arch 427, 24 (1994); 7. Cytometry 20,

181 (1995); 8. J Biol Chem 270, 23895 (1995); 9. J Biol Chem 270, 7791 (1995); 10. J Neurosci 14, 2464 (1994); 11. J Neurosci 14, 2260 (1994);

12. J Biol Chem 269, 6803 (1994); 13. J Cell Biol 133, 1041 (1996); 14. J Cell Biol 133, 1053 (1996); 15. J Immunol Methods 177, 101 (1994);

16. Hum Immunol 37, 264 (1993)

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LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit* 7

Thermo Fisher Scientific LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit 取扱説明書

ブランド: Thermo Fisher Scientific

モデル: LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit

タイプ: 取扱説明書

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