Thermo Fisher Scientific Zenon Goat IgG Labling Kit 取扱説明書
- タイプ
- 取扱説明書
製品情報
2007
年
6
月
19
日改
訂
MP 25602 Zenon® Goat IgG Labeling Kit
Zenon® Goat IgG Labeling Kit
はじめに
Zenon® Goat IgG Labeling Kit は、抗体コンジュ
ゲート調製用の迅速かつ汎用的で信頼性のある
方法を提供します。しかも、スタートサンプルは
ごく少量（µg 以下）からでも可能です。Zenon®
テクノロジーを用いて調製した抗体コンジュゲ
ートは、フローサイトメトリー、イメージング、
ハイスループットなど、直接標識した一次抗体を
利用するすべてのアプリケーションにおいて、細
胞染色に用いることができます。以前は、複数の
ヤギ由来抗体を同一の染色プロトコールに使用
するといったアプリケーションは時間がかかり、
実用的ではありませんでしたが、このようなアプ
リケーションも本テクノロジーにより簡略化で
きます。Zenon® Goat IgG Labeling Kit は、ヤギ IgG
抗体を標識するためのキットで、豊富な高品質蛍
光色素を取りそろえています（表 1）。
Zenon®標識テクノロジーでは、インタクトな
IgG 一次抗体の Fc 部位に選択的な、フルオロフォ
ア標識した Fab フラグメントを用いて標識複合体
を生成します（図 1）。標識 Fab フラグメントは、
製造過程においてアフィニティ精製され、一次抗
体の Fc 部位に対する高い親和性および選択性が
確保されています。Zenon®標識法は免疫選択性を
利用していますので、複合体生成前に、抗体から
血清アルブミンのような外因性タンパク質やア
ミン含有バッファーを取り除く必要はありませ
ん。他の種由来の抗体との交差反応性は低く抑え
られています。
Fab フラグメント・抗体複合体は 5分以内に形
成でき、混合反応液中のほぼすべての一次抗体が
標識されます。Zenon®テクノロジーにより形成さ
れた複合体は、直接標識した一次抗体と同等の蛍
光強度または酵素活性を示します。さらに、標識
Fab フラグメントと一次抗体のモル比を変えるな
ど、添加する Zenon®標識試薬の量を変更すること
で、抗体の標識の程度（すなわちプローブの蛍光
強度または酵素活性）を調節することが可能です。
ご質問に関しましては当社テクニカルサポー
ト部門までご連絡ください。
図1．Zenon®標識の模式図。未標識 IgG をフルオロフォ
ア標識した Fab フラグメントを含む Zenon®標識試薬と
インキュベートします（A）。標識 Fab フラグメントは
IgG 抗体の Fc 部位と結合し（B）、過剰の Fab フラグメ
ントは非特異的 IgG を添加して中和します（C）。非特
異的 IgG を添加することにより、同一タイプの一次抗
体が複数存在する実験において交差標識を防ぐことが
できます。
試薬
Zenon® Goat IgG Labeling Kit には、50 反応分の
標識に必要な量の試薬が含まれています（下記の
内容物
をご覧ください）。アフィニティ精製した
インタクトなヤギ IgG 抗体 1 µg を、Fab と抗体の
モル比が 3：1の条件で標識するのに必要な Zenon®
標識試薬の量を標識反応１回分とします（注 A）。
内容物
低分子量色素またはビオチンによる標識用
Zenon® Goat IgG Labeling Kit：
• Zenon®ヤギ IgG 標識試薬（Component A）、250
µL
• Zenon®ブロッキング試薬（ヤギ IgG ）
届いた製品はすぐに下記の条件下で保存して
ください：
• 2～6˚C
• 遮光条件下
吸収
/
蛍光波長：
表1 参照
ひとこと
未標識 IgG 抗体 Zenon 標識試薬
（標識 Fab フラグメント）
インキュベーション
標識 Fab フラグメン
トと IgG との結合
非特異 IgGと混合して
過剰な Fab フラグメ
ントと結合
Zenon® Goat IgG Labeling Kit 2
（Component B）、250 µL
表1．Molecular Probes のZenon® Goat IgG Labeling Kit
*およその吸収および発光の極大（nm 単位）。†複数の吸収ピークが存
在します。
Zenon®ヤギ IgG 標識試薬は、標識ウサギ Fab
フラグメントで、ヤギ IgG 抗体の Fc 部位に選択
性を示します。低分子量色素とコンジュゲートし
たZenon®ヤギ IgG 標識試薬は、5 mM のアジ化ナ
トリウムを含む pH 7.5 の0.1 M リン酸ナトリウム、
0.1 M 塩化ナトリウム溶液中に、Fab フラグメント
を200 µg/mL の濃度で含む試薬として提供されて
います。Zenon®ブロッキング試薬（ヤギ IgG）は、
5 mM のアジ化ナトリウムを含む pH 7.2 のリン酸
緩衝食塩水中、5 mg/mL の濃度の試薬として提供
されています。
保存および取り扱い
Zenon® Goat IgG Labeling Kit は、お手元に届き
次第、いずれも 2～6˚Cで保存し、蛍光物質を含
む試薬は遮光条件下で保存してください。長期間
保存する場合、低分子量フルオロフォアを含む
Zenon®ヤギ IgG 標識試薬および Zenon®ブロッキ
ング試薬は、単回使用量に分注し、-20˚C以下で
冷凍保存が可能です。
Zenon®
複合体の形成
以下に示すプロトコールは、抗体 1 µg を
Zenon®ヤギ IgG標識試薬で標識する場合のプロト
コールで、Fab と抗体のモル比は 3：1となります
（注 A）。このモル比は、実験開始濃度として推
奨されているもので、大半のアプリケーションに
おいて、十分な標識を行うことができる必要最小
限のモル比となっています。ただし、実験によっ
ては、モル比を高くしないと十分なシグナルを得
られない場合もあります（注 B）。使用する抗体量
が多いか少ない場合は、本プロトコールに示す試
薬量を必要に応じてスケールアップまたはスケ
ールダウンすることが可能です。Zenon®ヤギ IgG
標識反応では、抗体試料に含まれる可能性のある
ウシ血清アルブミン（BSA）や他の安定化タンパ
ク質を除去する必要はありません。血清中に含ま
れる抗体も直接標識することができ、標識前後の
抗体精製は必要ありません。
1.1 リン酸緩衝食塩水（PBS）などの適切なバッフ
ァーを用いて抗体 1 µg を調製してください。容量
は、20 µL 以下であれば問題ありません。濃度が
不明の抗体を使用する場合には、注 Cを参照して
ください。アフィニティ精製されていない抗体を
使用する場合は、注 Dを参照してください。
1.2 抗体溶液に Zenon®ヤギ IgG 標識試薬
（Component A）5 µL を加えてください。
1.3 混合溶液を室温で 5分間インキュベートして
ください。
1.4 Zenon®ブロッキング試薬（Component B）5 µL
を混合反応溶液に加えてください。単一標識抗体
のみを用いるアプリケーションに関しては、注 E
を参照してください。
1.5 溶液を室温で 5分間インキュベートしてくだ
さい。
上記の操作により使用準備の整った複合体は、
約30 分以内に試料と反応させてください。これ
よりも長期間の保存が必要な場合は、注 Fを参照
してください。
一般的アプリケーション情報
コンジュゲートの使用：Zenon®テクノロジーによ
って標識されたヤギ IgG 抗体は、直接標識した抗
体を利用できるすべてのアプリケーションに適
していると考えられます。Zenon®試薬で標識した
複数のヤギ IgG 抗体は、一つの実験において、連
続的に使用することも単一の染色混合液にして
使用することも可能です。
コンジュゲートの安定性：コンジュゲートが形成
され、過剰な Fab フラグメントをブロッキング試
薬で除去したら、標識複合体は約 30 分以内に使
用してください。
使用濃度：直接標識した一次抗体を主に使用する
アプリケーションでは、Zenon®テクノロジーを用
いて標識した抗体は通常、直接標識した一次抗体
と同等かそれより高い濃度（1.5～3倍）で使用す
ることが可能です。
標識 カタログ番号
Alexa Fluor 色素
Zenon® Goat IgG Labeling Kit 3
シグナルがほとんど検出されない：適切なコント
ロールで一次抗体の標的への結合が確認されて
いるにもかかわらず、Zenon®テクノロジーを用い
て標識した抗体でシグナルが検出されない場合、
Zenon®標識試薬を追加して Fab と抗体のモル比を
増加させるか、一次抗体の最終濃度を増加させる
ことでシグナルが増加する可能性があります。多
くの場合、3：1のモル比が適切ですが、モル比は
6：1まで増加させることが可能です。6：1以上
にモル比を増加させてもシグナル強度の顕著な
増加にはつながりません。
標識の損失または移動：標識 Fab フラグメントは
一次抗体と共有結合しているわけではないため、
時間経過に伴って標識 Fab フラグメントが多少失
われる可能性があります。複数のヤギ IgG 一次抗
体を用いるアプリケーションにおいては、Fab フ
ラグメントが一つの一次抗体から他の一次抗体
へ徐々に移動することもあります。ホルムアルデ
ヒドを用いた染色後の固定化ステップを追加し
てFab の解離を減らす必要があります（下記の
染
色アプリケーション
をご覧ください）。
染色アプリケーション
以下に示すプロトコールは、Molecular Probes
社において、Zenon®ヤギ IgG 標識試薬で標識した
一次抗体を用いて、細胞および組織を染色するた
めに開発されました。実験によっては、本プロト
コールをそのまま適用できない可能性もありま
すので、これらのプロトコールをお客様のニーズ
に合わせて変更されることをお勧めします。
免疫細胞化学
本プロトコールは、MRG-5 細胞（ヒト線維芽
細胞）の染色に成功しています。十分な量の標的
が存在する一次抗体の場合には、Zenon®標識試薬
（Fab）と抗体のモル比が 3：1となる条件で Zenon®
標識複合体を形成させるのが適切です。標的の量
が少ない場合には、モル比を 6：1とすることを
推奨しています。
2.1 適切な培地を用いて細胞を培養してください。
顕微鏡観察用の接着性細胞株は、スライドガラス
またはカバーガラス上で直接培養することが可
能です。ただし、染色操作中は、スライドガラス
またはカバーガラスが乾燥しないようにしてく
ださい。
2.2 細胞試料を、4%のホルムアルデヒドを含む
PBS 溶液中、室温で 15 分間固定してください。
または、ホルムアルデヒド添加後、5% CO2雰囲気
下、37˚Cで15 分間インキュベートして固定する
ことも可能です。後者の固定法のほうが、細胞骨
格形態をよりよい状態で保存できることが確認
されています。
2.3 細胞試料を 1回以上 PBS で洗浄してください。
2.4 試料を、0.1%のTriton® X-100 を含む PBS 溶
液中、室温で 5分間インキュベートし、細胞の透
過処理を行ってください。界面活性剤溶液を除去
します。
2.5 細胞試料を、10%の正常ヤギ血清（NGS）お
よび 3%のウシ血清アルブミン（BSA）を含む PBS
溶液中で 30 分間処理し、細胞試料中の非特異的
結合部位をブロックします。
2.6 Zenon®標識複合体（上記 Zenon®
複合体の形成
に従って調製したもの）を、10%のNGS を含む
PBS 溶液を用いて、必要な使用濃度に希釈し、細
胞試料を浸漬するのに十分な容量を添加してく
ださい。数種類の Zenon®標識複合体を用いて染色
を行う場合、すべての複合体を合わせて単一の染
色溶液とすることが可能ですので、1種類ずつ連
続的に染色を行う必要はありません。一次抗体の
濃度がすでに二次的検出試薬用に最適化されて
いる場合には、一次抗体の濃度を 1.5～3倍高くし
てZenon®標識法に用いてください。もしくは、各
実験に適切な濃度を、経験的に決定することが必
要です。
2.7 細胞試料を室温で 30～60 分間インキュベー
トしてください。フルオロフォアを用いた Zenon®
標識試薬は、インキュベーション中に遮光する必
要があります。染色が完了したら、細胞試料を PBS
で1回以上洗浄してください。
2.8 4%のホルムアルデヒドを含む PBS 溶液中で
細胞試料の 2回目の固定を室温で 15 分間行って
ください。固定が完了したら、細胞試料を 1回以
上PBS で洗浄してください。Zenon® Fab フラグメ
ントは、一次抗体に共有結合しているわけではな
いため、この 2回目の固定を行わないと、時間と
共に解離します。特に多色アプリケーションでは
他の一次抗体に移動することさえあります。この
工程は、単一の一次抗体を用いる実験においては
オプションですが、通常 2回目の固定を行うこと
でシグナル強度が増強されます。
2.9 必要に応じて、核酸染色剤（Hoechst 33342、
DAPI または SYTOX® Green 染色剤等）または他
の標識試薬（フルオロフォア標識ファロイジン
等）で細胞試料を対比染色してください。各染色
工程の後には必ず PBS での洗浄を行ってくださ
い。
Zenon® Goat IgG Labeling Kit 4
2.10 必要であれば、細胞をスライドガラスまたは
カバーガラスにのせるか、あるいはフローチュー
ブ内に入れてください。細胞を顕微鏡観察する際
には、アンチフェード封入剤にて封入してくださ
い（ProLong®アンチフェードキット、P7481 を使
用してください）。適切な方法で、試料の分析ま
たは観察を行ってください。
フローサイトメトリー
Zenon® Goat IgG Labeling Kit をフローサイト
メトリーアプリケーションに使用する試験は特
に実施しておりませんが、以下に示すプロトコー
ルは Zenon®マウス、ウサギ、およびヒト抗体標識
キット用に開発され、問題なく使用できることが
確認されています。本プロトコールは抹消血単核
細胞の染色用に開発されたものですが、他のタイ
プの細胞または全血試料にも容易に応用するこ
とができます。十分な量の標的が存在する一次抗
体の場合には、Zenon®標識試薬（Fab）と抗体の
モル比が 3：1となる条件で Zenon®標識複合体を
形成させるのが適切です。標的が少量の場合には
モル比を増加させる必要があります。Zenon®テク
ノロジーによって標識した抗体を用いる場合に
はFc ブロッキングの工程が不要であることに注
目してください。
4.1 細胞懸濁液または血液試料を任意の方法で調
製してください。
4.2 培養細胞（1 × 106細胞/mL）100 µL または
全血試料 100 µL をフローサイトメトリーチュー
ブに添加してください。
4.3 （オプション）細胞試料を、4%のホルムアル
デヒドを含む PBS 溶液中、室温で 15 分間固定し
てください。細胞試料を PBS で洗浄し遠心分離操
作によって細胞をペレット化し、上清を廃棄して
ください。細胞を残りのバッファーに再懸濁して
ください。注意：本工程および以降の工程は、細
胞内マーカーを検出する場合にのみ必要です。細
胞表面に対する抗体と細胞内マーカーに対する
抗体を一つの実験で同時に用いる場合には、先に
細胞表面マーカーの染色を行ってから、本工程お
よび 4.4～4.7 の工程に従って細胞内マーカーの染
色を行ってください。
4.4 （オプション）細胞試料を、0.1%のTriton
X-100 を含む PBS 溶液中、室温で 5分間インキュ
ベートし、細胞の透過処理を行ってください。細
胞試料を PBS で洗浄し、遠心分離操作によって細
胞をペレット化し、上清を廃棄してください。細
胞を残りのバッファーに再懸濁してください。
4.5 一次抗体 1 µg を、上記の Zenon®
複合体の形
成
に従って標識してください。
4.6 Zenon®標識混合溶液（ステップ 4.5 で調製し
たもの）の全量を試料チューブに添加してくださ
い。注意：全血試料を用いる場合、赤血球の溶解
を行うのは、細胞染色の前と後のどちらでも構い
ません（ステップ 4.6～4.7）。
4.7 試料を室温で 30 分間インキュベートしてく
ださい。フルオロフォアを用いた Zenon®標識試薬
は、インキュベーション中に遮光する必要があり
ます。インキュベーションが完了したら、細胞を
一度 PBS で洗浄した後、遠心分離操作によって細
胞をペレット化し、上清を廃棄してください。細
胞を残りのバッファーに再懸濁してください。イ
メージングアプリケーションに必要な染色後の
固定化は、フローサイトメトリーにおいては必要
ありません。
4.8 適切な装置パラメータを用いて、試料の分析
を行ってください。
注
[A] 標識プロトコールにおいて Zenon®ヤギ IgG標
識試薬の使用量を決定する際、Fab と抗体の比は
重要な因子です。すべての Zenon® Goat IgG
Labeling Kit に付属の Zenon®標識試薬は、Fab
フ
ラグメントの質量に基づき
、200 µg/mL の濃度で
提供されます。Fab フラグメントの分子量は約 50
kDa、一方インタクトな IgG の分子量は約 150 kDa
です。したがって、すべての Zenon®標識試薬にお
いて、その 5 µL をヤギ IgG 抗体 1 µg と混合する
とFab と抗体のモル比は、3：1となります。
[B] 標識する抗体の量または Fab と抗体のモル比
を調節する際には、常に同量の Zenon®標識試薬と
Zenon®ブロッキング試薬を使用することが重要
です。例えば、Zenon®標識試薬の使用量を 10 µL
に増加した場合は、Zenon®ブロッキング試薬の使
用量も 10 µL に増加させてください。抗体 1 µg あ
たり Zenon®標識試薬 10 µL を添加すること（モル
比は 6：1となります）により、しばしば測定シ
グナルが約 50%増加することに注目してください。
モル比をこれ以上増加させても、シグナル強度の
増加幅は減少していきます。
[C] ヤギ IgG の濃度が特定されていない場合は、
各メーカー等に問い合わせ、少なくとも IgG のお
よその含有量に関する情報を入手してください。
提供先に問い合わせても濃度が分からない場合
には、Zenon®標識試薬による滴定を行って最適な
標識条件を決定する必要があります。
Zenon® Goat IgG Labeling Kit 5
[D] 提供先から入手できる抗体は、通常、アフィ
ニティ精製された画分、IgG 画分、または血清中
成分として提供されています。アフィニティ精製
されていない一次抗体でも、Zenon®ヤギ IgG 標識
試薬で標識することが可能で、非特異的 IgG や血
清タンパク質を除去する必要はありません。ステ
ップ 1.2 において Zenon®標識試薬の適切な添加量
を、標識する試料中の IgG 総量を用いて決定する
ことが必要です。IgG 1 µg あたり Zenon ヤギ IgG
標識試薬 5 µL を使用してください。非特異的 IgG
も特異的 IgG と同時に標識されますが、標識され
た非特異的 IgG は、試料を染色しても検出可能な
ほどではなく、染色工程において洗い流されます。
[E] ヤギの細胞または組織を使用せず、また単一
標識の抗体のみが必要なアプリケーションの場
合、標識プロトコールのステップ 1.4 および 1.5
（ブロッキング試薬の添加）を省略できます。複
合体化していない Zenon®標識試薬のシグナル強
度は低く、バックグラウンドのシグナル強度を増
加させることはありません。
[F] 標識複合体を長期間保存する場合、標識手順
をステップ 1.3 の段階で中断してください。この
段階であれば、2 mM のアジ化ナトリウムを保存
剤として用いることで、複合体を 4˚Cで数週間保
存することができます。保存しておいたコンジュ
ゲートを使用する際には、プロトコールのステッ
プ1.4 および 1.5 を完了してからコンジュゲート
を実験試料に添加してください。
製品リスト 現在の価格は、当社ウェブサイトまたはカスタマーサービス部門から入手いただけます。
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