Thermo Fisher Scientific Gateway LR ClonaseII 取扱説明書

ブランド
Thermo Fisher Scientific
モデル
Gateway LR ClonaseII
タイプ
取扱説明書
Gateway®LR クロナーゼ™II 酵素ミックス
カタログ番号 11791-020 サイズ：20 反応分
カタログ番号 11791-100 サイズ：100 反応分
-20°Cで保存（自動霜取り機能を持たないフリーザー）
※長期保存には-80℃での保存をお薦めします。
Gateway®テクノロジー
Gateway®テクノロジーは、λファージの部位特異的組換え反応（1）を利用して DNA 配列を迅速
かつ効率的に移し換える、汎用性の高いクローニング技術です。以下に、Gateway®テクノロジー
の概略を示します。
attB1-遺伝子-attB2 × attP1-ccdB-attP2 ⇔ attL1-遺伝子-attL2 × attR1-ccdB-attR2
（発現クローン） （ドナーベクター） （エントリークローン） （デスティネーションベクター）
Gateway®BP クロナーゼ™II 酵素ミックスは attB×attP間の組換え反応を触媒し、Gateway®LR クロ
ナーゼ™II 酵素ミックスは attL×attR間の組換え反応を触媒します。「ccdB」は Fプラスミドにコ
ードされた大腸菌の生育を阻害する遺伝子（2、3）を、「遺伝子」は任意の目的 DNA 断片（PCR
産物、cDNA、ゲノム DNA など）を意味します。
製品概要
Gateway®LR クロナーゼ™II 酵素ミックスは、酵素とバッファーを混合したプレミックスタイプの
試薬です。λファージ由来のインテグラーゼ（Int）、切出し酵素（Xis）、大腸菌由来の組込み宿主
因子（IHF）（1）、および反応バッファーを混合したもので、反応液の調製を簡便に行えます。
Gateway®LR クロナーゼ™II 酵素ミックスは、エントリークローン（attL-遺伝子-attL）と attRサ
イトを持つデスティネーションベクターとの間の in vitro 組換え反応を触媒し、attBサイトを持つ
発現クローンを生成します。Gateway®LR クロナーゼ™II 酵素ミックスは、-20°C（自動霜取り機
能を持たないフリーザー）で最長 6ヵ月間保存できます。なお、長期保存する場合には、-80°C
での保存をお薦めいたします。
内容 20 反応 100 反応
Gateway®LR クロナーゼ™II 酵素ミックス 40 μL 200 μL
Proteinase K 溶液（2 μg/μL） 40 μL 200 μL
pENTR™-gus ポジティブコントロール（50 ng/μL） 20 μL 20 μL
品質管理
組換え反応を 1 時間行った後に形質転換を実施することにより、LR クロナーゼ™II 酵素ミックス
の機能を確認しています。
パート番号 11791.II.pps 更新日：2011 年1月31 日
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推奨事項およびガイドライン
• LR 反応のポジティブコントロール用に、pENTR™-gus が添付されています。pENTR™-gus は、
シロイヌナズナの β-グルクロニダーゼ（gus）遺伝子を含むエントリークローンです（4）。
pENTR™-gus のマップおよび配列は、弊社のウェブサイトで検索していただけます。
（http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support.html）
• LR 反応には PureLink™HQ Mini Plasmid DNA 精製キット（カタログ番号 K2100-01）で精製し
たプラスミドの使用をお奨めします。その他一般的なミニプレップ（アルカリ溶解）により
調製されたプラスミドは Gateway®クローニング反応に適していますが、反応効率が低下する
可能性がありますので、できるだけ精製度の高いプラスミドをご使用ください。
• LR 反応の効率のよい基質として、attLサイトを持つスーパーコイル状のエントリークローン
および attRサイトを持つスーパーコイル状のデスティネーションベクターを使用できます。
ただし、ベクターを直鎖状にすることにより組み換え効率が上昇することが知られています。
特にサイズの大きい（10 kb を超える）エントリークローンまたはデスティネーションベクタ
ーを使用する場合は、ベクターを直鎖状にすることをお奨めします。
• 目的の発現クローンを含むコロニー数を増加させるには、インキュベーション時間を推奨の 1
時間から、2時間～一晩に延長させてください。10 kb 以上のプラスミドを使用して組み換え
を行う際は、インキュベーション時間を長くすることをお奨めします。
• 10 μLの反応液あたり 50～150 ng のエントリークローンを使用することをお奨めします。エン
トリークローンの量が多すぎると複数の DNA 分子を含むコロニー（多くの場合、コロニーサ
イズが小さくなります）の出現が問題になることがあります。その際は、使用するエントリ
ークローンの量を少なめ（50 ng 程度）にしてください。
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手順
LR
反応
LR クロナーゼ™II 酵素ミックスは 5倍濃度の溶液です。反応容量を変更する場合は、LR クロナ
ーゼ™II 酵素ミックスの最終濃度が 1倍となるようにしてください。ポジティブコントロールに
ついては、pENTR™-gus を100 ng（2 μL）ご利用ください。
1. 室温でチューブに以下の試薬を加えて混合します。
エントリークローン（50-150 ng） 1-7 μL
デスティネーションベクター（150 ng/μL） 1 μL
TE バッファー（pH8.0） トータル 8 μL
2. LR クロナーゼ™II 酵素ミックスを氷上で約 2分間静置し解凍します。LR クロナーゼ™II 酵
素ミックスをよく混合します。
3. 各サンプル（上期ステップ 1）に 2 μLのLR クロナーゼ™II 酵素ミックスを加えてよく混合
します。軽く微量遠心分離機にかけます。
4. LR クロナーゼ™II 酵素ミックスを-20°Cまたは-80°Cのフリーザーに戻します。
5. 混合物を 25°Cで1時間インキュベーションします。
6. 1 μLのProteinase K 溶液を各サンプルに加えよく混合した後、37°Cで10 分間インキュベーシ
ョンします。
形質転換
1. 1 μLのLR 反応液を 50 μLのOne Shot®OmniMAX™2 T1 Phage-Resistant Cells（カタログ番号
C8540-03）に添加します。氷上で 30 分間インキュベーションします。42°Cで30 秒間インキ
ュベーションして細胞にヒートショックを与えます。250 μLのS.O.C.培地を加え、37°Cで攪
拌しながら 1時間インキュベーションします。20 μLおよび 100 μLの形質転換物をセレクシ
ョン用プレート上に撒きます。注：形質転換率が>1.0 × 108形質転換体/μgであれば、どんな
コンピテントセルでも使用できます（ただし、ccdB 耐性株は使用できません）。
2. （形質転換効率の評価）上記に従い 1 μLのpUC19 DNA（10 pg/μl）を用いて 50 μLのOne
Shot®OmniMAX™2 T1 Phage-Resistant Cells を形質転換します。20 μLおよび 100 μLを、100
μg/mL のアンピシリンを含む LB プレート上に撒きます。
予想される結果
効率の高い場合は、LR 組換え反応液全てを形質転換に使用し、全量をプレートに撒いた場合、5000
個を超えるコロニーが生成されます。
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