Thermo Fisher Scientific Gateway Technology pgs 1-9 ユーザーガイド

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Thermo Fisher Scientific
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Gateway Technology pgs 1-9
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ユーザーガイド
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Gateway®テクノロジー
Gateway の
基本原理 Gateway®テクノロジーは、λファージが大腸菌染色体へ侵入する際に関与す
る部位特異的組換えシステムを基礎としています（Ptashne, 1992）。Gateway®
テクノロジーでは、λファージの組換えシステムのコンポーネントを改変す
ることで、組み換え反応の特異性および効率を高めています（Bushman et al,
1985）。このセクションでは、Gateway®テクノロジーの基礎となっているλフ
ァージの組換え反応の概要について説明します。
組換えに関与する
コンポーネント
λファージの組換えシステムは、以下の 2つの主要コンポーネントから構成
されています。
• DNA 組換え配列（att 配列）
• 組換え反応を仲介するタンパク質（クロナーゼ™酵素ミックス）
この 2つのコンポーネントについては以下で説明します。
組換え反応の
特徴
λファージの大腸菌染色体へのインテグレーションは、λファージおよび大腸
菌にコードされた組換えタンパク質の混合物（クロナーゼ™酵素ミックス）
によって仲介される DNA 分子間の組換えによって起こります。以下に、λ
ファージの組換え反応の特徴を挙げます。
• 組換えは、特異的に相互作用する DNA 配列（att 配列）間で起こります。
• 組換えは保存的（ヌクレオチド数に変化はない）であり、DNA 合成を必
要としません。組換え後の att 配列が、各親ベクター由来の配列から構成
されるハイブリッド配列になるように、組換え部位に隣接する DNA 断片
が置換されます。例えば、attL配列は、attB配列と attP配列から構成さ
れています。
• DNA 鎖の交換は、すべての att 配列に共通するコア領域内で起こります
（以下を参照）。
• 組換え効率は異なりますが、どのようなトポロジーの DNA（直鎖状 DNA、
スーパーコイル状 DNA、またはリラックス状 DNA）の間でも組換えは起
こります。
λファージの組換えに関する詳細は、参考文献および総説（Landy, 1989;
Ptashne, 1992）を参照してください。
att 配列 λファージの組換えは、部位特異的な組み換え部位間（大腸菌染色体上の attB
配列とλファージ染色体上の attP配列）で起こります。att 配列には組換えタ
ンパク質が結合する部位があり、その特徴はよく調べられています（Weisberg
& Landy, 1983）。λファージの組込みの際に、attB配列と attP配列との間で組
換えが起り、attL配列と attR配列が生じます。実際の交差は、2つの att 配
列の相同な 15 bp のコア領域で起こりますが、組換えタンパク質の結合部位
がある周囲の配列も重要です（Landy, 1989）。
次ページに続く
4
Gateway®テクノロジー（続き）
組換えに関与する
タンパク質
λファージの組換え反応は、複数の酵素の混合物により触媒されます。この
酵素混合物がゲノム上の特異的な配列（att 配列）に結合し、組み換え部位を
引き寄せ切断し、DNA を再度結合します。2対の DNA 鎖が交差し、その後
DNA のライゲーションが起こることにより組換えが完結します。反応に関
与するタンパク質は、λファージが溶菌経路（大腸菌ゲノムからの切り出し）
を利用するのか溶原化経路（大腸菌ゲノムへの組込み）を利用するのかによ
って異なります（以下に示す表を参照）。
溶原化経路は、λファージのインテグラーゼ（Int）と大腸菌の組込み宿主因
子（IHF）タンパク質（BP クロナーゼ™酵素ミックス）が関与し、溶菌経路
は、Int、IHF の他、λファージ由来の切出し酵素（Xis）（LR クロナーゼ™
酵素ミックス）が関与します。組換え酵素に関する詳細は、参考文献および
総説（Landy, 1989; Ptashne, 1992）を参照してください。
経路 反応 触媒酵素
溶原化 attB × attP → attL × attR BP クロナーゼ™II (Int、IHF)
溶菌 attL × attR → attB × attP LR クロナーゼ™II (Int、Xis、IHF)
Gateway®
組換え反応
Gateway®テクノロジーは、λファージの組換えシステムを利用して、ベクタ
ー間で、改変した att 配列に挟まれた DNA 配列の交換反応を行う技術です
（Hartley et al, 2000）。Gateway®テクノロジーは、以下に示す 2つの組換え反
応から構成されています。
• BP 反応：attPを持つ DNA（ドナーベクター）と attBを持つ DNA（attB-PCR
産物または直鎖状の attB発現クローン）との組換えを行い、attLを持つ
エントリークローンを生成します（以下に示す図を参照）。BP クロナー
ゼ™酵素ミックスがこの反応を仲介します。
• LR 反応：attRを持つ DNA（デスティネーションベクター）と attLを持つ
DNA（エントリークローン）の組換えを行い、attBを持つ発現クローンを
生成します（以下に示す図を参照）。LR クロナーゼ™酵素ミックスがこの
反応を仲介します。
attBが隣接する
PCR 産物または
attB発現クローン
ドナーベクター エントリークローン 副産物
BP クロナーゼ™
LR クロナーゼ™
エントリークローン デスティネーション
ベクター
発現クローン 副産物
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Gateway®BP および LR 組換え反応
はじめに 野生型 λファージの att 組換え配列を改変し、Gateway®BP および LR 組換え反
応の効率および特異性を向上させています。このセクションではこの改変につ
いて説明すると共に、attB配列 × attP配列と attL配列 × attR配列間の Gateway®
組換え反応の例を示します。
att 配列の改変
Gateway®システムでは、野生型 λファージの att 組換え配列を以下に示す方法
で改変し、Gateway®BP および LR 組換え反応の効率および特異性を高めてい
ます。
• 終止コドンを除去し、かつ組換え反応の特異性を上げて挿入方向とリーデ
ィングフレームを維持できるよう att 配列のコア領域に変異が導入されて
います。
• 一本鎖状の attBプラスミド（ファージミド ssDNA または mRNA など）の
二次構造形成を最小限にするために、attB配列の 15 bp コア領域に隣接す
る短い（5 bp）領域に変異が導入されています。
• attR配列の 43 bp を除去し、in vitro のattL × attR反応を不可逆的かつより
効率的にしています（Bushman et al, 1985）。
重要
上記の改変に加えて、複数の att 配列に部位特異的点変異を導入して組換え効
率を高めています。その結果、att 配列に多型が存在する場合があります。例
えば、pDONR™201 のattP1 配列は pDONR™221 のattP1 配列とわずかに異な
っています。ただし、このような配列の多型は、特異的な組換え反応やベクタ
ーの機能に影響を及ぼしません。
改変された
att 配列の特徴
改変された att 配列には、以下のような特徴および特異性があります。詳細に
ついては 6ページおよび 7ページの図を参照してください。
att 配列 長さ 存在場所
attB 25 bp 発現ベクター
発現クローン
attP 200 bp
ドナーベクター
attL 100 bp
エントリーベクター
エントリークローン
attR 125 bp
デスティネーションベクター
特異性：
• attB1 配列は、attP1 配列とのみ反応します。
• attB2 配列は、attP2 配列とのみ反応します。
• attL1 配列は、attR1 配列とのみ反応します。
• attL2 配列は、attR2 配列とのみ反応します。
次ページに続く
6
Gateway®BP および LR 組換え反応（続き）
attB × attP
組換え反応の例 以下の図は、attB-PCR 産物と pDONR™221 または pDONR™/Zeo ベクターと
の間の BP 組換え反応のスキームを示しています。この組換え反応によって、
エントリークローンと副産物が生成します。
注：pDONR™221 とpDONR™/Zeo 以外のドナーベクターを使用する場合、組
換え領域の配列がわずかに異なることがありますが、組換えの機序は同じで
す。
組換え領域の特色：
• 網掛け領域は、組換えにより attB-PCR 産物からエントリークローンに移し
換わった配列です。attL配列が、attB配列と attP配列で構成されているこ
とに注目してください。
• 囲み線の領域は、組換えにより pDONR™221 または pDONR™/Zeo から副
産物に移し換わった配列です。
attB-PCR 産物
ドナーベクター
エントリークロ
ーン
副産物
7
Gateway®BP および LR 組換え反応（続き）
attL × attR
組換え反応の例 以下の図は、pENTR™/D-TOPO®を用いて作成したエントリークローンと
pcDNA™6.2/V5-DEST（デスティネーションベクター）との間の LR 組換え反
応を示しています。この組換え反応によって、発現クローンと副産物が生成し
ます。
注：他のベクターを使用する場合、組換え領域の配列がわずかに異なること
がありますが、組換えの機序は同じです。
組換え領域の特色：
• 網掛け領域は、組換えによりエントリークローンから発現クローンに移し
換わった配列です。attB配列が、attL配列と attR配列で構成されているこ
とに注目してください。
• 囲み線の領域は、組換えにより pcDNA™6.2/V5-DEST から副産物に移し換
わった配列です。
エントリークロ
ーン
デスティネーシ
ョンベクター
発現ベクター
副産物
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Gateway®ベクターの特色
Gateway®
ベクター
弊社では、Gateway®に適した 3タイプのベクターを販売しております。
Gateway®ベクター 特徴
ドナーベクター
（pDONR™）
attP配列を含んでいます。
attB配列を両端に付加した PCR 産物（attB-目的遺伝子
-attB）をクローニングして、エントリークローンを作
生成するために使用します。
エントリーベクタ
ー（pENTR™）
attL配列を含んでいます。
att配列を含まない PCR 産物または制限酵素切断断片を
クローニングして、エントリークローンを作成するた
めに使用します。
デスティネーショ
ンベクター
attR配列を含んでいます。
LR 組換え反応において、エントリークローンと組換え
を行い、発現クローンを作成します。
各発現システム（大腸菌、哺乳類、酵母、昆虫）で目
的遺伝子を発現させるのに必要な構成要素を含んでい
ます。
Gateway®
ベクターに
共通する特色
エントリークローンまたは発現クローンの組換えクローニングを効率的に行う
ために、大部分の Gateway®ベクターは、2つの att 配列に挟まれた以下の遺伝
子からなるカセットを含んでいます。
• ネガティブセレクション用の ccdB遺伝子（以下を参照）（ドナーベクター、
デスティネーションベクターとスーパーコイル状のエントリーベクターに
存在します）。
• カウンターセレクション用のクロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）（ド
ナーベクターとデスティネーションベクターに存在します）。
BP 組換え反応または LR 組換え反応の際に、この遺伝子カセットが目的遺伝子
と入れ換わり、BP 組換え反応後にはエントリークローンが、LR 組換え反応後
には発現クローンが生成されます。
ccdB遺伝子 ccdB遺伝子が存在するため、組み換え、形質転換後に、大腸菌の中でドナーベ
クターおよびデスティネーションベクター（およびいくつかのエントリーベク
ター）のネガティブセレクションを行えます。CcdB タンパク質は、大腸菌の
DNA ジャイレースを阻害することで（Bernard & Couturier, 1992）、大部分の大
腸菌株（OmniMAX™2-T1R、DH5α™、TOP10 など）の増殖を阻害します。組
換えがデスティネーションベクターとエントリークローン、ドナーベクターと
attB-PCR 産物との間で起こる場合、ccdB遺伝子は目的遺伝子と入れ換わりま
す。ccdB遺伝子を含む組換え反応を起こしていないベクター、および ccdB遺
伝子を持つ副産物を取り込んだ細胞は増殖することができません。これにより、
目的のクローンを高効率に回収することができます。
Gateway®
ベクターの増幅
CcdB タンパク質には致死作用があるので、ccdB遺伝子を含む Gateway®ベクタ
ーは必ず、CcdB の致死作用に耐性のある大腸菌株で増幅してください。CcdB
の致死作用に耐性のある ccdBサバイバル 2T1R大腸菌株のご使用をお奨めしま
す（カタログ番号 A10460）。
9
Gateway®の命名法
命名法
Gateway®ベクターおよびクローンを簡単に分類できるように、一例として以
下の命名法を提案しています。
プラスミド型 説明 各ベクター／クローンの名称
attLベクター エントリーベク
ター
pENTR1、pENTR2、…
attLサブクローン エントリークロ
ーン
pENTR3-gus、…；pENTR221-gus
数字の 3はエントリーベクターを表しま
す。
221 はエントリークローンの作製に使用
したドナーベクターを表します。
gus はサブクローニングした遺伝子の名
称です。
attRベクター デスティネーシ
ョンベクター
pDEST1、pDEST2、pDEST3…；p…-DEST
attBベクター 発現ベクター pEXP501、pEXP502、…
このベクターは発現 cDNA ライブラリー
の作成に使用します。
attBサブクローン 発現クローン pEXP14-cat、…；pcDNA/GW-47/cat
14 および 47 は、発現クローンの作製に
使用したデスティネーションベクター
（それぞれ pDEST™14 と
pcDNA-DEST47™）を表します。
cat はサブクローニングした遺伝子の名
称です。
attPベクター ドナーベクター pDONR201、pDONR221、...
例：LR 反応
1. pENTR201-tet × pDEST14→pEXP14-tet
2. pENTR221-cat × pcDNA-DEST47→pcDNA/GW-47/cat
例：BP 反応
1. attB-p53 PCR 産物 × pDONR221→ pENTR221-p53
2. pEXP14-lacZ × pDONR201→ pENTR201-lacZ
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