Thermo Fisher Scientific TURBO DNA リファレンスガイド

ブランド: Thermo Fisher Scientific

モデル: TURBO DNA

タイプ: リファレンスガイド

A. 製品説明

Ambion Ambion® TURBO DNA-free™ DNase Treatmentおよび

Removal Reagentsは、精製したRNA中にコンタミネーションしたＤＮＡ

を除去し、さらに反応後のサンプルからDNaseと2価のイオンを除去す

るようにデザインされた製品です。キットに採用されているTURBO

DNase （特許出願中）は、野生型のDNase Iに対して350％以上の触

媒効率をもつ組換え型の酵素であり、DNAに対して非常にアフィニティ

が高いため、微量にコンタミネーションしたDNAであってもより効果的

に除去することが可能です。さらに生理的塩濃度の溶液中での活性を

比較すると、TURBO DNaseはDNase Iに対して最大50倍の高い活

性を維持します。キットに付属するTURBO DNaseは、アニマルフリー

のシステムで過剰発現によって合成されており、”Bovine-free”のプロ

セスでしっかりと精製し、チェックを受けています。またRNase活性が

完全に除去されていることを保証しています。またキットには、TURBO

DNase酵素の活性100倍以上まで上げることが可能な小分子エンハ

ンサーを含有する最適化されたDNase reaction bufferが添付されて

います。TURBO DNA-freeを用いてたテストでは、コンタミネーションし

たDNAが一般的なPCRによって検出限界以下まで分解されることを

確認しています（図1）。反応後のDNaseは、フェノール/クロロホルム抽

出、アルコール沈殿、加熱またはEDTAの添加を必要としない最新の

方法を用いて短時間で簡単に除去することが可能です（表1を参照）。

TURBO DNA-free処理されたRNAは、エンドポイントまたはリアルタイ

ムRT-PCR、マイクロアレイ解析、RPA解析、Northern解析、その他さ

まざまなRNA解析に適しています。

2 A. Product Description

図1. TURBO DNA-free™は、500万倍以上のコンタミネーションしたゲノムDNAを除去

マウス脾臓からのtotal RNA（AmbionのRNAqueous® Kitを用いて精製）を130μL

の反応系にTURBO DNaseを7.8U添加し37℃で20分間処理をおこなった。一方、同

量を分取しDNase処理を行わない未処理サンプルとした。DNase反応は22 μL

DNase Inactivation Reagentを加えることによって止めた。次にTaq-Man® primer

probeを用いてマウスGAPDHを検出を行った。反応は25μLの反応系に対して5 μL

（1 μg RNA分）を添加し、1ステップRT-PCRで行った。DNase処理および未処理サ

ンプルは、AmbionのMessageSensor™ RT Kitを用いて逆転写を行った。またDNAコ

ンタミネーションのコントロールとして、各サンプルに RT-マイナスサンプルを設定し

PCR反応を行った。 TURBO DNase処理したRT-マイナスサンプルの結果も確認で

きるように、リニアスケールで増幅曲線を表示した。

ゲノムDNAの除去倍数(5.4 x 106倍)は以下のように計算された。未処理RNAを用い

たRT-マイナス反応の値は、gDNAコンタミネーションのレベルを示している。除去倍

数は未処理サンプルのCt値（17.13）から処理サンプルのRT-マイナス反応のCt値

（39.5： n=2で検出を行ったが、一方は検出不能であった）を引き算し、このCt値の

差を2を底とする指数関数に累乗した。。

表1. TURBO DNA-free™によるRNAの処理は、リアルタイムRT-PCRで

ターゲット遺伝子の検出感度を維持する。

β-actinのCt値（n=2）

RNA treatment 100 pg RNA 1 pg RNA

none 24.78 / 24.67

31.83 / 31.53

TURBO DNA-free treated 24.50 / 24.62

30.89 /30.88

cdc-2のCt値（n=2）

none 28.88 / 28.24

34.41 / 35.50

TURBO DNA-free treated 27.71 / 28.10

34.04 / 33.99

HeLa S3細胞由来のtotal RNAをプロトコルに従ってTURBO DNA-free™ Kitで処理した。

さらに、5 μL分のRNAを、逆転写し、得られたcDNAを、TaqMan®検出でヒトβ-アクチンま

たはCDC-2に対してリアルタイムRT-PCRを行った。

A. Product Description 3

DNase Inactivation Reagent はDNase酵素を除去するだけでな

く、マグネシウムやカルシウムのような過熱処理によってRNAの分

解を触媒する2価の陽イオンも除去します（図２）。

Nuclease-

free

Water

10X TURBO

DNase Buffer

–

+ + TURBO DNase

–

+ –

DNase Inactivation Reagent

–

+ + + Heated 75ºC, 10 min

6 –

4 –

28S

2 –

18S

1 –

0.5 –

0.2 –

L 1 2 3 4

図2. DNase Inactivation Reagentによる二価陽イオンの除去

HeLa-S3 由来のtotal RNA(100ng) を 50 μL-TURBO DNase Buffer もしくは

nuclease-free waterに溶解した状態のサンプルを用意し、上記で示すようにTURBO

DNA-free™ kitのコンポーネントで処理を行った。TURBO DNase Bufferからの二価

陽イオンが溶液に残存し、RNAが分解されるかを確認するために、サンプルを75℃

で10分間(レーン2, 3, 5)、または90℃で3分間(レーン4)加熱した。各サンプルから1

μLずつ分取し、Agilent 2100 bioanalyzerを用いてRNA LabChip®で分析した。

TURBO DNase Bufferに溶解したRNAはこの処理によって分解されたが、DNase

Inactivation Reagentで処理したサンプル中のRNAは分解されなかった（レーン5）；

これは加熱によってRNA分解を誘導する2価の陽イオンによるものである。

4 B. Procedure Overview

B. 手順概要

詳細な手順については、5ページのセクションEを参照のこと。

図3. TURBO DNA-free™ 手順概要

DNase Digestion Reagentsを加える

インキュベート

DNase Inactivation Reagentを添加する

インキュベートと混合

遠心し、RNAを新しいチューブへ移す

1. RNAに0.1倍量の10X TURBO DNase Buffe

および

1 μLのTURBO DNaseを添加し、穏やかに混合する。

2. 37℃で 20～30 分間インキュベートする。

3. 再懸濁した DNase Inactivation Reagent を添加し (通

常0.1 倍量)、よく混ぜる。

4. 室温で5分間インキュベートする（インキュベート

中に数回混合する）。

5. 10,000x g で1.5 分間遠心し、RNA を新しいチューブへ移

す。

. How Much RNA Can Be Treated with TURBO 5

C. TURBO DNA-free™でどれくらいのRNAを処理可能か？

このプロトコールは精製済のRNAサンプル中に存在する微量～中程

度量（最大50μg DNA/ mL RNA）のコンタミネーションしたDNAを除

去できるようにデザインされており、処理後はRT-PCRでも影響のない

レベルまで除去されます。完全にDNAのコンタミネーションのないRNA

を得ることができるRNA抽出法はありません。実際に、一部の組織(脾

臓、腎臓または胸腺など)から抽出されるRNAには比較的高いレベル

のDNAが含まれてしまいます。また有機溶媒法では液層分離の際の

中間層のキャリーオーバーが、ガラスファイバーフィルターによる精製

法では過剰量のサンプルのロードがDNAのコンタミネーションの原因

となります。

D. TURBO DNA-freeコンポーネントおよび保存条件

Kitには50回分の TURBO DNA-free処理（それぞれ100μL以下の反

応液量で処理した場合）に必要な試薬が含まれています

量成分ストレージ

120 μL

TURBO DNase (2 Units/μL)

–20°C

600 μL

10X TURBO DNase Buffer

–20°C

600 μL

DNase Inactivation Reagent

–20°C

1.75 mL

Nuclease-free Water any temp*

* Nuclease-free waterは‐20℃、4℃、または室温で保存してください。

TURBO DNA-free Kitを長期保存する場合は結露防止機能のない冷

蔵庫で-20℃で保存してください。なお10X TURBO DNase Bufferおよ

びDNase Inactivation Reagentは、4℃で1週間まで保存することがで

きます。

E. TURBO DNA-free手順

手順メモ

• DNase Inactivation Reagentの処理後、上清の回収を容易にす

るために0.5mLチューブを用いて操作することをお薦めします。

6 E. TURBO DNA-free Procedure

• TURBO DNA-free反応は、96-wellプレートで行うことができます。

なおプレートはV底のタイプの使用をお薦めします。V底の形状は

最後のステップでペレット化されたDNase Inactivation Reagent

からRNAを回収するのに適しています。

• 反応容量は、10～100 μLをお薦めします。通常は50μLで反応し

ます。

1. RNAに0.1倍量の10X TURBO DNase Bufferおよび1 μL の

TURBO DNaseを添加し、穏やかに混合します。

コンタミネーションしているDNA量や処理するサンプルの核酸濃度に

応じてDNase処理の条件を変えて反応を行います。

•

通常の

DNase

処理

1 mLあたり≤200 μgの核酸を処理する場合

•

厳格な

DNase

処理

: 1 mLあたり>200 μgの核酸を処理する場

合、またはDNAがかなりコンタミしたRNA(e.g. >2 μg DNA/50 μL)

を処理する場合

通常の

DNase

処理

: 50 μL反応系において処理するRNA量は最大

10μgまでとし、1μLのTURBO DNase (2 U)を添加して反応を行いま

す。この反応条件では、50μL反応系で、total RNAから最大2μgのゲノ

ムDNAを除去することができます。

厳格な

DNase

処理

処理するRNAサンプルの濃度が1 mLあたり200

μg以上の場合、TURBO DNase BufferおよびTURBO DNaseを添加

する前に、サンプルを10μg-nucleic acid/50μLに希釈します。最初に

TURBO DNaseの半分のみを反応に加えて、30分間インキュベート

し、次に酵素の残りを加えて、さらに30分間インキュベートするのが効

果的です。

サンプルを希釈できない場合、添加するTURBO DNaseの量を2～3

μL（4～6 U）に増やしてください。 10～100 μLのTURBO DNA-free反

応系において最大500μg/mLの濃度のサンプルからコンタミネーション

したDNAを効果的に除去できると予想されます。しかしながら非常に

濃度の高いサンプルを処理する場合、その効果はコンタミネーションし

ているDNAの絶対レベルに依存します。そのためDNAは35～40サイ

クルのPCR反応によって検出される場合もあれば、検出される場合も

あります。

E. TURBO DNA-free Procedure 7

2. 37℃で20～30分間インキュベートします。

step.1でTURBO DNaseを規定の半量しか添加しなかった場合、まず

30分間インキュベート後、残り半量のTURBO DNaseを添加し、さらに

30分間インキュベートしてください。

3. よく懸濁したDNase Inactivation Reagent （通常0.1倍量）を加え

て、よく混合します。

DNase Inactivation Reagentを添加する前に、チューブを弾くか、ボ

ルテックスすることによって必ず再懸濁します。

•

通常の

DNase

処置の場合

： 2 μL または0.1 倍量のDNase

Inactivation Reagentを添加します。このとき添加量が多くなる方

の条件を選択してます。例えばstep1 で50 μL-RNA に1μL-

TURBO DNaseを添加した場合は、5 μLのDNase Inactivation

Reagentを添加します。

•

厳格な

DNase

処置の場合

： 2～3μLのTURBO DNaseを用いた

場合、0.2倍量のDNase Inactivation Reagentを添加します。

重要

0.1

倍量以上であっても添加量が

以下の場合は、最低でも

2μL

の

DNase Inactivation Reagent

を添加してください。

注記

DNase Inactivation Reagent

は、使用を繰り返していくうちに保存液

が乾燥によって減少してしまい、ピペット操作が困難になる可能性があ

ります。

このような場合、残りの

DNase Inactivation Reagent

の総容

積の約

～

25%

程度の

Nuclease-free Water (

キット添付

)

の量を加え

て、しっかりとボルテックスで混合し、ピペットで分取できるようにしてく

ださい。

4. 室温で5分間インキュベートします（ときどき混合してください）。

DNase Inactivation Reagentを分散させるためにチューブを弾いて、2

～3回混合してください。

注記

室温が

～

℃以下になっている場合、温度を制御するために、チュ

ーブをヒートブロックまたはオーブンの方へ移してください。

低温下で

は

TURBO DNase

の不活化の効率が低下するため、

RNA

サンプルに

DNase

が残ってしまうので注意してください。

8 F. Troubleshooting

5. 10,000x gで1.5分間遠心し、RNAを新しいチューブへ移します。

• 96wellプレートを用いた場合は、2,000x gで5分間遠心してください。

この遠心分離操作により、DNase Inactivation Reagentをペレット化し

ます。遠心後、慎重に上清（RNAを含む）を新しいチューブに移しま

す。以後の操作で酵素的な反応に用いる場合、DNase Inactivation

Reagentを持ち込まないようにしてください。2価の陽イオンが捕獲され

たり、Buffer条件を変えてしまう可能性があります。

F. トラブルシューティング

1. TURBO DNA-free処理したRNAを用いたところRT-PCR産物

が検出できなかった場合

DNase Inactivation ReagentがRT-PCRを阻害する場合があります。

8ページのstep.E.5で、ペレット化したDNase Inactivation Reagentを

RNAサンプルに持ち込まれないように、注意してRNA溶液を回収する

必要があります。このとき完全に除去するためにはRNA溶液を少量残

す必要があります。また操作の際に誤ってペレットに触れてしまった場

合、再度遠心を行いDNase Inactivation Reagentをペレット化させてく

ださい。

TURBO DNA-free処理したRNAをRT-PCR反応に用いる場合、添

加量は反応液量のおよそ20%程度に抑えてください。

RT-PCRに用いる場合、TURBO DNA-free処理したRNAの添加量は

RT-PCR反応の最終液量に対しておよそ20％程度に抑え、40%を超

えないことを推奨します。規定以上の量を添加した場合、TURBO

DNase bufferやDNase Inactivation buffer由来の成分が反応を阻害

する可能性があります。20～40％を超えないために、RT-PCR反応液

の液量を50μL以上に増やすことによって調整することは可能です。

RNAをRT-PCRに用いる場合、TURBO DNA-free処理は１回の

みにしてください。

TURBO DNA-free 反応に用いられる塩条件は、最適なTURBO

DNase活性が得られるように慎重にバランスが保たれています。

TURBO DNA-free処理を２回繰り返して処理したRNAでは追加の塩

が持ち込まれてしまい、以後の酵素反応をベースとするアプリケーショ

ンに悪影響を与えることがあります。DNase処理を２回行う必要がある

場合、オンライン上で公開しています“TURBO DNA-free 2nd Digest

Protocol”をしてください。

www.ambion.com/techlib/append/supp/digest.html

F. Troubleshooting 9

2. 60℃に加熱したところ、RNAが分解してしまった場合

マグネシウムやカルシウムといった二価の陽イオンが含まれている

RNAサンプルは、60℃以上に加熱することによって分解されてしまい

ます。確実に二価の陽イオンを除去するために、7ページのステッ

プ.E.4のインキュベーション中に2～3回反応液を混合することによっ

て、DNase Inactivation Reagentを懸濁させてください。

3. TURBO DNA-free処理後のRNAが通常と異なる吸収スペクトル

を示した場合

サンプル中のRNA濃度がおよそ50ng/μL以下の場合、230nm近辺

の吸光度が顕著な値を示す場合があります。さらにRNA濃度が25ng/

μL以下の場合は、A260/A280比も通常よりも低い値を示す場合があり

ます。こうした吸光度値のプロファイルの変化はTURBO DNase

Buffer中に含まれるエンハンサーの影響によるものです。Ambionでは

エンハンサー処理をしたRNAサンプルと、処理を行わなかったRNAサ

ンプルを用いて徹底的な比較を行った結果、RNA濃度が10ng/μL未

満でなければ、エンハンサーが正確なRNA濃度の定量に影響を与え

ないことを確認しています。さらに詳しい情報については以下を参照く

ださい。

www.ambion.com/catalog/supp/absorbance.html

化学物質の安全基準

化学物質の危険を最小化するため:

• 化学物質または有害物質を保存、取り扱いまたは使用する前に、

化学メーカーによって提供されるMaterial Safety Data Sheets

（MSDS）を読んで、理解してください。

• 化学物質による接触は最小限になるようにしてください。化学物質

を取り扱う場合は、適切な保護具、(例：安全ゴーグル、手袋、保

護衣)を着用してください。なお追加の安全基準については、

MSDSを確認してください。

• 化学物質の吸入は最小限になるようにしてください。薬品容器を

開いたままにしないでください。必ず適切な換気(例：換気フード)

条件下で使用してください。なお追加の安全基準については、

MSDSを確認してください。

• 化学物質の液漏れまたは流出について定期的に確認してくださ

い。液漏れまたは流出が起こった場合、MSDSで推奨するように

メーカーの清掃手順に従って処理してください。

• 薬品保管、取扱いおよび廃棄については、地方、州/地域、また

は国によって定めらているすべての法律および規制を遵守してく

ださい。

10 F. Troubleshooting

MSDSについて

化学メーカーは、有害化学物質の出荷の際に、最新のMaterial

Safety Data Sheets（MSDS)を新規顧客に提供します。また、

MSDSがアップデートされた場合、変更後最初の有害化学物質の出

荷の際にMSDSを顧客に提供します。 MSDSは、安全に化学物質を

保管、取扱い、輸送、および廃棄するのに必要な安全情報を提供し

ます。

有害化学物質に添付されるMSDSについて新しいものを受け取る度

に、適切にファイルされている古いMSDSと置き換えてください。

MSDSの入手

Applied BiosystemsまたはAmbionによって供給される化学製品に

対する製品安全データシート(MSDS)は以下の方法で入手してくださ

い。

• www.appliedbiosystems.comのWeb上で、“Support”を選択

し、次に“MSDS”を選択してください。化学物質名、製品名、または

製品番号またはMSDS番号により検索してください。右クリックして、

MSDSを印刷またはダウンロードしてください。

• www.ambion.comのweb上で、関心のある商品に関するカタロ

グページにアクセスしてください。 MSDSをクリックし、右クリック

して印刷またはダウンロードしてください。

• 電子メール

（MSDS_Inquiry_CCRM@appliedbiosystems.com）、電話

(650-554-2756;USA)またはファックス（650-554-2252;USA）に

てカタログまたは部品番号および製品名を指定して請求を行って

ください。ファックスまたは郵便配達を指定されてない場合は、通

常MSDSは電子メールで送付します。郵便での送付を希望され

た場合、お届けに1～2週間を必要とします。

注記:Applied BiosystemsまたはAmbionから提供されない化学物質

のMSDSについては、化学メーカーに問い合わせてください。

G. Quality Control 11

G. 品質管理

機能テスト

TURBO DNaseの活性は、ユニット活性アッセイで機能的にテストさ

れています。 1ユニットは、37°Cで10分間で、1 μgのDNAを完全に

分解するために必要な酵素の量として定義されています。結果はア

ガロースゲル電気泳動によって確認されます。DNase Inactivation

Reagentについては、TURBO DNaseおよびTURBO DNase Buffer

の成分が除去できているかをテストされます。結果は、それぞれ、ア

ガロースゲル電気泳動およびAgilent 2100バイオアナライザによって

確認されます。

ヌクレアーゼテスト

関連するキット構成品は、以下のヌクレアーゼアッセイで試験される:

RNase活性

サンプルを標識RNAとともにインキュベート後、PAGEによって確認

し、規格適合またはそれ以上であることを確認しています。

非特異的エンドヌクレアーゼ活性

サンプルをスーパーコイル状態のプラスミドDNAとともにインキュベ

ート後、アガロースゲル電気泳動によって確認し、規格適合またはそ

れ以上であることを確認しています。

エキソヌクレアーゼ活性

サンプルを標識した二本鎖DNAとともにインキュベート後、PAGEに

よって確認し、規格適合またはそれ以上であることを確認していま

す。

プロテアーゼテスト

サンプルをプロテアーゼ基質とともにインキュベート後、蛍光分析に

よって確認し、規格適合またはそれ以上であることを確認していま

す。

Manual 1907M Revision F Revision Date: June 9, 2009

For research use only. Not for use in diagnostic procedures. By use of this product, you

accept the terms and conditions of all applicable Limited Label Licenses. For state-

ment(s) and/or disclaimer(s) applicable to this product, see below.

Information in this document is subject to change without notice. Applied Biosystems

assumes no responsibility for any errors that may appear in this document.

Applied Biosystems disclaims all warranties with respect to this document,

expressed or implied, including but not limited to those of merchantability or

fitness for a particular purpose. In no event shall Applied Biosystems be liable,

whether in contract, tort, warranty, or under any statute or on any other basis for

special, incidental, indirect, punitive, multiple or consequential damages in

connection with or arising from this document, including but not limited to the use

thereof.

Literature Citation: When you are describing a procedure utilizing this

product in a Materials and Methods Section for publication, we would

appreciate that you refer to it as the TURBO DNA-free™ Kit.

Warranty and Liability: Applied Biosystems is committed to delivering superior

product quality and performance, supported by industry-leading global service and

technical sup-port teams. Warranty information for the accompanying consumable

product is available at www.ambion.com/info/warranty in “Limited Warranty for

Consumables,” which is subject to the exclusions, conditions, exceptions, and

limitations set forth under the caption “EXCLUSIONS, CONDITIONS, EXCEPTIONS,

AND LIMITATIONS” in the full warranty statement. Please contact Applied Biosystems

if you have any questions about our warranties or would like information about post-

warranty support.

Patents and Licensing Notifications: This product is compatible with the 5' nuclease

detection and dsDNA-binding dye processes covered by patents owned or licensable

by Applied Biosystems. No license under these patents is conveyed expressly, by

implication, or by estoppel to the purchaser by the purchase of this product. Further

information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of

Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404,

USA.

Trademarks: Applied Biosystems, AB (Design), Ambion, and RNAlater are

registered trademarks; and MEGAclear, TURBO, and DNAZap are trademarks of

Life Technolo-gies Corporation or its affiliates in the US and/or certain other

countries. All other trademarks are the sole property of their respective owners.

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Thermo Fisher Scientific TURBO DNA リファレンスガイド

ブランド: Thermo Fisher Scientific

モデル: TURBO DNA

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