Thermo Fisher Scientific Invivofectamine 2.0 Reagent 取扱説明書

ブランド
Thermo Fisher Scientific
モデル
Invivofectamine 2.0 Reagent
タイプ
取扱説明書
Invivofectamine® 2.0 Reagent
カタログ番号 1377501 サイズ：1 mL スターターキット
カタログ番号 1377505 サイズ：5 × 1 mL
4°C保存（凍結不可）
概要
Invivofectamine® 2.0 は、当社が独自に開発した、動物由来成分を含まない、脂質ベースの in vivo
用RNAi トランスフェクション試薬です。本試薬は、尾静脈への注入により、肝臓において高い
in vivo トランスフェクション効率を示すもので、全身性の siRNA 導入用にデザインされています。
Invivofectamine® 2.0 は、Ambion® In Vivo siRNA および当社の Stealth RNAi™ siRNA のin vivo 導入
に最適です。Invivofectamine® 2.0 の毒性の低さに加え、低圧で少量の siRNA を導入することによ
り、動物のストレス反応を回避します。siRNA をBLOCK-iT™蛍光コントロールと組み合わせる
ことで、siRNA の体内分布を解析することも可能となります。
キット内容
内容物 1377501 1377505
Invivofectamine® 2.0 Reagent 1 mL 5 × 1 mL
Complexation Buffer 1 mL 5 × 1 mL
Ambion® In Vivo FVII siRNA（マウス）
（凍結乾燥ポジティブコントロール） 50 nmol −
保存
Invivofectamine® 2.0 は、適切な方法で保存すれば、6ヵ月間安定です。
使用目的
この製品は研究用です。ヒト、動物の診断または治療用としては承認されておりません。
in vivo 導入における重要なガイドライン
y Ambion® In Vivo siRNA またはインビトロジェンの in vivo Purityグレードの Stealth RNAi™の2
本鎖 siRNA は、動物試験用として製造され、in vivo での RNAi 実験への使用が推奨されてい
ます。
y Invivofectamine® 2.0 は、尾静脈投与による肝細胞への導入用に最適化されています。他のアプ
リケーションおよび投与経路に関しては、試験されておりません。
y 実験の開始用量としては、7 mg/kg を推奨しています。これは、体重 20 g のマウスに
0.7 mg/mL濃度の溶液を 200 µL注入する用量（10 µL/g）に相当します。
パート番号：100010263 MAN0003202 更新日：2010 年8月13 日
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Invivofectamine® 2.0 とsiRNA の複合体の調製
使用する用量（例：7 mg/kg）に応じて必要な量の Invivofectamine® 2.0 とsiRNA の複合体を調製
してください。siRNA の量のスケールアップまたはスケールダウンは、複合体の透析または透析
濾過後に、必要な最終濃度になるように調整して行ってください。
お客様にご用意いただくもの
y 2本鎖 siRNA（3 mg/mL 濃度の DNase/RNase フリー水溶液、約 0.2 mM）
y pH7.4 のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（カタログ番号 10010-031）
y 2 mL または 50 mL の滅菌チューブ
y UltraPure™ DNase/RNase フリー滅菌水（カタログ番号 10977-023）
y
透析プロトコール
：Spectra/Por Float-A-Lyzer® G2 8-10 KD
（Spectrum Medical Laboratories社製、カタログ番号 G235031）
y
透析濾過プロトコール
：Amicon® Ultra-15 Ultracel-50 遠心式フィルターユニット（ミリポア社
製、カタログ番号 UFC905024、UFC910024）
2本鎖 siRNA の調製
2本鎖 siRNA をDNase/RNase フリー水で再懸濁または希釈して、3 mg/mL濃度のストック溶液を
調製してください。Ambion® In Vivo FVII siRNA のポジティブコントロールは、250 µL の
DNase/RNase フリー水に懸濁してください。siRNA を完全に懸濁させるため、必要に応じてボル
テックスしてください。未使用の試料は-20˚Cで保存してください。
透析プロトコール（推奨プロトコール）
本プロトコールは、最終濃度が 0.7 mg/mL未満の siRNA 溶液用の推奨プロトコールです。以下に、
Float-A-Lyzer® G2 カセットを用いて、PBS 中で 0.7 mg/mL の複合体を 1 mL 調製するプロトコー
ルを示します。
1. 250 µL のsiRNA ストック溶液（3 mg/mL）と 250 µL のComplexation Bufferを混合し、1.5
mg/mL のsiRNA 溶液を 500 µL 調製します。
2. Invivofectamine® 2.0 Reagent を室温に戻し、その 500 µL を2 mL のチューブに移します。
3. 希釈した siRNA 溶液（上記ステップ 1で調製した溶液）を 2 mL のチューブ内の
Invivofectamine® 2.0 に直接加え、直ちに 2～3秒間ボルテックスします。
4. Invivofectamine® 2.0 とsiRNA の混合物を 50˚Cで30 分間インキュベートします。
5. 軽く遠心を行い試料を回収します。
6. Float-A-Lyzer®透析装置は、メーカー推奨の方法に従って滅菌水に 10 分間浸して行ってく
ださい。
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7. Invivofectamine® 2.0 とsiRNA の混合物を Float-A-Lyzer®透析装置に加え、1 L のPBS（pH
7.4）中で、穏やかに攪拌しながら室温で 2時間インキュベーションします。複数の試料を
ご使用の際には、少なくとも 500 倍量以上の PBS を用いて透析を行ってください。
8. 試料を回収し、容量を測定します（容量は約 10％増加する可能性があります）。容量から
siRNA の濃度を算出します。目的の濃度となるように、PBS を加えて容量を調整してくだ
さい。
9. Invivofectamine® 2.0 とsiRNA の複合体の in vivo 投与を始めます。直ちに使用しない場合、
この複合体は 4˚Cで最大 1週間保存可能です。
透析濾過プロトコール
本プロトコールは、投与量を少なくする必要がある場合で、最終濃度が 0.7 mg/mL 以上の siRNA
溶液用の推奨プロトコールです。以下に、Amicon® Ultra-15 Ultracel-50kDa 遠心式フィルターユニ
ットを用いて、PBS 中で 1.4 mg/mL の複合体を 0.5 mL 調製するプロトコールを示します。
1. 250 µL のsiRNA ストック溶液（3 mg/mL）と 250 µL のComplexation Buffer を混合し、1.5
mg/mL のsiRNA 溶液を 500 µL 調製します。
2. Invivofectamine® 2.0 Reagent を室温に戻し、その 500 µL を50-mL コニカルチューブに移し
ます。
3. 希釈した siRNA 溶液（上記ステップ 1で調製した溶液）を 50-mL のチューブ内の
Invivofectamine® 2.0 に直接加え、直ちに 2～3秒間ボルテックスします。
4. Invivofectamine® 2.0 とsiRNA の混合物を 50˚Cで30 分間インキュベーションし、軽く遠心
して試料を回収します。
5. 約14 倍量（14 mL）の PBS（pH 7.4）をコニカルチューブに加え、混合します。
6. Amicon® Ultra-15 カラムを、メーカーの方法に従って準備します。
7. コニカルチューブの内容物を、洗浄済みの Ultracel-50 メンブレン付き Amicon® Ultra-15 遠
心式フィルターユニットに移します。
8. メーカーの方法に従って、（希釈した混合溶液 15 mL あたり）30 分から 1時間遠心分離し
ます。
重要：蛍光標識された RNAi（例：BLOCK-iT™蛍光コントロール）を使用する場合には、
メンブレンをよく洗浄して試料を回収してください。蛍光標識 RNAi がメンブレンに付着
している可能性があります。
9. Invivofectamine®2.0 とsiRNA の複合体を含んだ溶液を回収し、PBS を加えて容量を 500 µL
に調整してください。
10. Invivofectamine®2.0 とsiRNA の複合体の in vivo 投与を始めます。直ちに投与しない場合、
4˚Cで最大 1週間保存可能です。
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投与方法
一般注意事項
動物の取り扱いおよび実験は、国内規制および地方実験倫理委員会の承認に従って行ってくださ
い。動物を取り扱う者はすべて、当該地域施設において適正なトレーニングを受ける必要があり
ます。注入前（標準注入量は 200 µL です。ここに示した計算値は、体重 20 g のマウスを用いた
場合の値です。異なる体重のマウスを扱う場合には適宜調節してください）にマウスの体重を量
り、実験を通して体重の記録を続けることをお勧めします。お客様の Invivofectamine® 2.0 と
siRNA の複合体溶液の注入を確実に行うために、マウス用の拘束具や Tailveiner（Braintree
Scientific 社）の使用を推奨しています。
静脈内注入
1. 拘束具を用いて、マウスを拘束します。尾を見やすくするため、Tailveiner を使用すること
も可能です。
2. 静脈およびその拡張を見やすくするためには、ウォーターバスまたは加熱ランプを用いて
静脈を約 37˚Cに温めてください。尾をわずかに回転させて静脈の位置を確認したら、注入
部位をアルコール綿で消毒します。
3. わずかに角度をつけて針を挿入し、ゆっくりと（20～40 µL/秒）血液のクリアリングを確
認しながら注入します。抵抗が増し、尾にわずかな膨隆が見られた場合には、針を抜き取
り、先の注入部位の近位で同じ操作を繰り返してください。
4. 注入終了後、針を抜き取り、注射部位を約 5秒間押さえてください。
追加サポート
本製品のご使用に関する詳細情報、または技術サポートは、当社のウェブサイト
www.invitrogen.com/invivofectaine をご覧いただくか、テクニカルサポートまでご連絡ください。
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