Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System 取扱説明書

Applied Biosystems StepOne™

和 StepOnePlus™

Real-Time PCR Systems

试剂指南

Applied Biosystems StepOne™ 和

StepOnePlus™ Real-Time PCR

Systems

试剂指南

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Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MicroAmp, MultiScribe, NED,

ROX, StepOne, StepOnePlus, TAMRA, TET, and VeriFlex are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other

countries.

AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.

All other trademarks are the sole property of their respective owners.

部件号 4377715 Rev C

目录 Front Cover

iii

Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

前言

如何使用本指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

如何获取更多信息 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

如何获取支持 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xii

第 1 章简介

关于 StepOne™ 和 StepOnePlus™ 系统 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

支持的耗材 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

准备实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

选择实验类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

选择试剂类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-8

选择检测类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-9

第 2 章试剂概述

概述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Taq M an® 试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

SYBR® Green 试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4

选择适当的试剂类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6

尽量降低 DNA 污染 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6

第 3 章定量实验

第3.1 部分 :关于定量实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

概述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4

选择定量方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

选择一步法 RT-PCR 或两步法 RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-7

选择单一或多重 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-9

选择试剂类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-11

选择检测类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-11

iv Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

第3.2 部分 :设计指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15

Inventoried/Made to Order 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16

TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16

Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

选择母液 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-19

设计实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20

Custom 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21

使用 Primer Express® Software 设计引物和探针 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21

选择试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-24

使用建议的热循环条件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-27

优化引物浓度 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30

优化探针浓度 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-32

有关详情 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-34

第 4 章基因分型实验

第4.1 部分 :关于基因分型实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3

概述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4

选择检测类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6

第4.2 部分 :设计指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9

Pre-Designed/Validated 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . . . . . . . 4-12

选择母液 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13

设计实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

Custom 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

选择母液 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16

设计实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16

第 5 章存在/不存在实验

第5.1 部分:关于存在/不存在实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-3

概述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4

选择检测类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-5

v

Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

第5.2 部分 :设计指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9

Inventoried/Made to Order 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13

选择母液 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15

设计实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16

Custom 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16

附录 A 公式

使用标准曲线法计算标准差 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

使用比较法计算标准差 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-5

比较 CT (∆∆CT) 实验的公式 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-7

附录 B 多重 PCR 中的引物限制

附录 C 检测设计指南

附录 D 试剂部件号

定量实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2

Inventoried/Made to Order 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2

Custom 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2

基因分型实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5

Pre-Designed/Validated 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5

Custom 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-6

存在/不存在实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-7

Inventoried/Made to Order 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-7

Custom 检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-8

参考文献

术语表

索引

vi Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

vii

Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

前言

如何使用本指南

关于系统说明文档下文所列指南随 Applied Biosystems StepOne™ 和 StepOnePlus™ Real-Time PCR

Systems （以下简称 “StepOne™ 和 StepOnePlus™ 系统”）一起提供。

注意：本手册中使用 Applied Biosystems StepOneTM 和 StepOnePlusTM Real-

Time PCR Systems 指两种产品：Applied Biosystems StepOneTM Real-Time PCR

System 和 Applied Biosystems StepOnePlusTM Real-Time PCR System。

指南目的和目标读者部件号

中文版

部件号

Applied Biosystems StepOne™ and

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Getting

Started Guide for Genotyping Experiments

说明如何在 StepOne 和 StepOnePlus 系统

上执行实验。每个入门指南都可用作：

•教程，使用随 Applied Biosystems

StepOne™ Real-Time PCR Software （以

下简称 “StepOne™ 软件”）提供的示例

实验数据。

•您自己执行实验的指南。

专为使用 StepOne 或 StepOnePlus 系统执

行实验的实验室人员及主要研究人员而编写。

4376786 4377732

Applied Biosystems StepOne™ and

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Getting

Started Guide for Presence/Absence

Experiments

4376787 4377721

Applied Biosystems StepOne™ and

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Getting

Started Guide for Relative Standard Curve and

Comparative CT Experiments

4376785 4377739

Applied Biosystems StepOne™ and

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Getting

Started Guide for Standard Curve Experiments

4376784 4377733

Applied Biosystems StepOne™ and

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

Installation, Networking, and Maintenance

Guide

说明如何安装和维护 StepOne 和

StepOnePlus 系统。

专为负责安装和维护 StepOne 或

StepOnePlus 系统的实验室人员而编写。

4376782 4377795

Applied Biosystems StepOne™ and

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

Installation Quick Reference Card

4376783 4377789

Applied Biosystems StepOne™ and

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

Reagent Guide

提供有关您可在 StepOne 和 StepOnePlus

系统上使用的试剂的信息，包括：

•TaqMan

® 和 SYBR® Green 试剂简介

•以下实验类型的描述和设计指南：

–定量实验

–基因分型实验

–存在/不存在实验

专为使用 StepOne 或 StepOnePlus 系统执

行实验的实验室人员及主要研究人员而编写。

4379704 4377715

viii Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

前言

假定本指南假定您已具备以下条件：

•熟悉 Microsoft Windows® XP 操作系统。

•熟悉因特网和因特网浏览器。

•熟悉如何处理 DNA 和/或 RNA 样本并为 PCR 扩增准备这些样本。

•熟悉数据存储、文件传输以及复制和粘贴操作。

•若您计划将 StepOne 或 StepOnePlus 系统集成到您的现有实验室数据流

中，则需具备联网经验。

文字体例本指南采用以下体例：

•粗体文字表示用户操作。例如：

键入 0，然后对剩余的每个字段按一下 Enter 键。

•

斜体

文字表示新的或重要的内容，也用于表示强调。例如：

在开始分析之前，请

始终

准备好新鲜基质。

•右箭头符号 () 用于分开您从下拉菜单或快捷菜单中依次选择的多个命

令。例如：

依次选择 File （文件） Open （打开）。

用户警示文字在 Applied Biosystems 用户文档中，有两种用户警示文字。每种警示文字表示

需遵守事项或执行操作的不同重要性级别，如下所述：

注意：－提供使用产品的用户可能有兴趣或有帮助的信息，但并非使用产品

不可或缺的事项或操作。

切记！－提供正确操作仪器、精确使用试剂盒或确保安全使用某化学品所必

须遵守的要求或必须执行的操作。

Applied Biosystems StepOne™ and

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Site

Preparation Guide

说明如何准备场地以接收和安装 StepOne 和

StepOnePlus 系统。

专为为准备场地以便安装 StepOne 或

StepOnePlus 系统所需的任务制定日程表、

管理以及执行这些任务的工作人员而编写。

4376768 4378356

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

Software Help

说明如何使用 StepOne 软件以便：

•使用 StepOne 和 StepOnePlus 系统设

置、运行和分析实验。

•监视联网的 StepOne 和 StepOnePlus 扩

增仪。

•校准 StepOne 和 StepOnePlus 扩增仪。

•使用 RNase P 实验验证 StepOne 和

StepOnePlus 扩增仪的性能。

专为以下人员而编写：

•使用 StepOne 或 StepOnePlus 系统执行

实验的实验室人员及主要研究人员。

•负责安装和维护 StepOne 或

StepOnePlus 系统的实验室人员。

未提供未提供

指南目的和目标读者部件号

中文版

部件号

ix

Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

前言

用户警示文字示例如下：

注意：在控制台也可使用 Calibrate （校准）功能。

切记！要验证您的客户机连接，您需要一个有效用户 ID。

安全警示文字用户文档中也包括安全警示文字。有关详情，请参阅第 xii 页 “安全警示文

字”。

如何获取更多信息

相关文档其它 StepOne 和 StepOnePlus 系统文档

下面表格中所列的文档不随 StepOne 或 StepOnePlus 扩增仪提供。

与基因分型实验相关的文档

文档部件号

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR

Systems Installation Performance Verification Protocol

4376791

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR

Systems Installation Qualification-Operation Qualification Protocol

4376790

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR

Systems Planned Maintenance Protocol

4376788

文档部件号

Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Quick

Reference Card

4312212

Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol 4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431

Ordering TaqMan® SNP Genotyping Assays Quick Reference Card 4374204

Performing a Custom TaqMan® SNP Genotyping Assay for 96-Well

Plates Quick Reference Card

4371394

Performing a TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well

Plates Quick Reference Card

4367636

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856

xApplied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

前言

与存在/不存在实验相关的文档

与相对标准曲线和比较 CT 实验相关的文档

与标准曲线实验相关的文档

文档部件号

DNA Isolation from Fresh and Frozen Blood, Tissue Culture Cells, and

Buccal Swabs Protocol

4343586

NucPrep® Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant

Tissue Protocol

4333959

PrepMan® Ultra Sample Preparation Reagent Protocol 4318925

文档部件号

Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays

Application Note

127AP05

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits

Protocol

4375575

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

文档部件号

Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays

Application Note

127AP05

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

xi

Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

前言

与试剂指南相关的文档

注意：有关更多文档，请参阅第 xii 页“如何获取支持”。

从软件 Help （帮

助）系统中获取

信息

StepOne Software Help （StepOne 软件帮助）系统描述如何使用用户界面的每

项功能。要在软件中访问 Help （帮助）系统，请执行下列操作之一：

•按 F1 键。

•单击工具栏中的。

•依次选择 Help （帮助） StepOne Software Help （StepOne 软件帮助）。

要在 Help （帮助）中查找所需主题：

•查看目录。

•搜索特定主题。

•搜索按字母顺序排列的索引。

文档部件号

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits

Protocol

4375575

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines 4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431

Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol 4367218

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 4304965

SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol 4310251

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol 4308335

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2

✕

) Protocol 4351891

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol 4371135

TaqMan® Genotyping Master Mix Protocol 4371131

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856

TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol 4304449

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous

Control for Experimental Studies Application Note

127AP08

xii Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

前言

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此外，在 Support （支持）网页上还提供全球各地 Applied Biosystems 技术支

持和销售机构的电话和传真号码。

切记！当按照本指南的指导，或您需要安排维护您的 StepOne™ 或

StepOnePlus™ 扩增仪（如年度计划维护或温度验证/校准）时，请与

Applied Biosystems Care Center 联系。要获取中心的电话号码或向中心发送电

子邮件，请登录 http://www.appliedbiosystems.com/support/contact。

1-1

Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

1

简介 1

本章包括：

关于 StepOne™ 和 StepOnePlus™ 系统 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

支持的耗材 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

准备实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

选择实验类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

选择试剂类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-8

选择检测类型 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-9

1-2 Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

第

1

章简介

关于 StepOne™ 和 StepOnePlus™ 系统

该 Real-Time PCR System 有两个型号：

StepOne 和 StepOnePlus 系统使用基于荧光的聚合酶链反应 (PCR) 试剂执行检

测，提供：

•采用实时分析法定量检测靶核酸序列（以下简称 “靶序列”）。

•采用 PCR 扩增后（终点）分析法定性检测靶序列。

•PCR 产物的定性分析（通过发生在 PCR 扩增后的解链曲线分析获得）。

关于数据采集 StepOne 和 StepOnePlus 系统可根据扩增仪执行的实验类型，在 PCR 扩增期间

采集不同点上的原始荧光数据：

无论哪种运行类型，数据采集点或 StepOne™ 或 StepOnePlus™ 扩增仪

读取

均包

括三个阶段：

1. 激发－扩增仪对扩增仪内反应板上的所有反应孔照明，从而在每次反应

中激发出荧光。

2. 发射－扩增仪光学部件采集从反应板反应孔中发出的残余荧光。设备采

集的结果图像仅包括与发射波长范围相对应的光。

3. 采集－扩增仪以数字形式表现固定时间间隔内采集的残余荧光。

StepOne™ 软件存储原始荧光图像以便分析。

运行之后， StepOne 软件将使用校准数据（空间、染料和背景）以确定每次

读取中荧光信号的位置和强度、与每种荧光信号相关的染料和信号意义。

系统特征

Applied Biosystems StepOne™ Real-

Time PCR System （以下简称

“StepOne™ 系统”）

•48 孔平台

•三色系统

Applied Biosystems StepOnePlus™ Real-

Time PCR System （以下简称

“StepOnePlus™ 系统”）

•96 孔平台

•四色系统

•VeriFlex

™ 样本加热块

实验类型数据采集点

实时运行标准曲线扩增仪在每个 PCR 延伸步骤后采集数据。

相对标准曲线

比较 CT (∆∆CT)

PCR 扩增后

（终点）运行

基因分型扩增仪在以下时间点采集数据：

•PCR 扩增前（用于存在/不存在实验， PCR 扩

增前采集数据是可选项，但建议选择此选项。）

•（可选）在 PCR 扩增期间。扩增仪可在运行期

间（实时）采集数据；在运行期间采集数据有

助于进行故障排除。

•PCR 扩增后

存在/不存在

1-3

Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

第

1

章简介

关于滤光器 StepOne 和 StepOnePlus 系统使用以下滤光器：

关于 VeriFlex™

技术

StepOnePlus 扩增仪包含六个单独进行温度调节的 VeriFlex™ 样本加热块，帮

助优化热循环条件。您可将其中一个或几个 VeriFlex 样本加热块设置为一个

不同的温度，可创建最多六个不同的样本温度区，也可将所有六个 Ve ri Fl ex

样本加热块都设置为同一个温度。

有关详情有关本指南中所述的任何主题的详情，请按 F1 键，单击工具栏中的，或依

次选择 Help （帮助） StepOne Software Help （StepOne 软件帮助），以访

问 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR Software v2.0 的 Help （帮助）

信息。

StepOne 系统 StepOnePlus 系统

滤光器染料滤光器染料

1FAM™ 染料 1FAM™ 染料

SYBR® Green 染料 SYBR® Green 染料

2JOE™ 染料 2JOE™ 染料

VIC® 染料 VIC® 染料

3ROX™ 染料 3TAMRA™ 染料

NED™ 染料

4ROX™ 染料

1-4 Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

第

1

章简介

支持的耗材

StepOne 系统 StepOne 系统支持下列耗材。这些耗材可配合标准和 Fast 试剂/实验方案使用。

切记！即使在使用标准试剂执行实验时，在 StepOne 和 StepOnePlus 系统上也

只应使用 Fast 耗材（反应板、反应管条带和反应管）。

耗材部件号

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

•MicroAmp

™ 48-Well Optical Adhesive Film

• 4375816

• 4375323 和

4375928

•MicroAmp

™ Fast 8-Tube Strip

•MicroAmp

™ Optical 8-Cap Strip

• 4358293

• 4323032

•MicroAmp

® Fast Reaction Tube with Cap • 4358297

•MicroAmp

™ Fast 48-Well Tray

•MicroAmp

™ 48-Well Base Adaptor

•MicroAmp

™ 96-Well Support Base

• 4375282

• 4375284

• 4379590

G

A

C

D

C

F

B

C

# 耗材

AMicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

BMicroAmp

™ Fast 48-Well Tray

CMicroAmp

™ 96-Well Support Base

DMicroAmp

™ Optical 8-Cap Strip

EMicroAmp

™ Fast 8-Tube Strip

FMicroAmp

® Fast Reaction Tube with Cap

GMicroAmp

™ 48-Well Optical Adhesive Film

HMicroAmp

™ 48-Well Base Adaptor

E

B

HH

1-5

Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

第

1

章简介

StepOnePlus

系统

StepOnePlus 系统支持下列耗材。这些耗材可配合标准和 Fast 试剂/实验方案

使用。

切记！即使在使用标准试剂执行实验时，在 StepOne 和 StepOnePlus 系统上也

只应使用 Fast 耗材（反应板、反应管条带和反应管）。

耗材部件号

•MicroAmp

™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate with

Barcode

•MicroAmp

™ Optical Adhesive Film

• 4346906 和

4366932

• 4360954 和

4311971

•MicroAmp

™ Fast 8-Tube Strip

•MicroAmp

™ Optical 8-Cap Strip

• 4358293

• 4323032

•MicroAmp

® Fast Reaction Tube with Cap • 4358297

•MicroAmp

™ 96-Well Tray for VeriFlex™ Blocks

•MicroAmp

™ 96-Well Support Base

• 4379983

• 4379590

•MicroAmp

™ Adhesive Film Applicator

•MicroAmp

™ Cap Installing Tool (Handle)

• 4333183

• 4330015

G

A

C

F

B

C

# 耗材

AMicroAmp

™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate

BMicroAmp

™ 96-Well Tray for VeriFlex™ Blocks

CMicroAmp

™ 96-Well Support Base

DMicroAmp

™ Optical 8-Cap Strip

EMicroAmp

™ Fast 8-Tube Strip

FMicroAmp

® Fast Reaction Tube with Cap

GMicroAmp

™ Optical Adhesive Film

D

C

E

B

1-6 Applied Biosystems StepOne™

和

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

试剂指南

第

1

章简介

准备实验

一般工作流程在 StepOne 和 StepOnePlus 系统上执行实验之前，请按如下步骤准备实验：

1. 选择实验类型（第 1-7 页）。

2. 选择试剂类型（第 1-8 页）。

3. 选择检测类型（第 1-9 页）。

本指南中的信息本章提供有关您可配合 StepOne 和 StepOnePlus 系统使用的实验类型、试剂类

型和检测类型的一般信息。

后续章节提供具体信息：

章次描述

第 2 章 “试剂概述” •描述 Taq Ma n ® 和 SYBR®Green 试剂并进行比较。

•提供有关尽量避免 DNA 污染的信息。

第 3 章 “定量实验” •说明实验类型的工作原理。

•提供实验类型的特定工作流程。

•提供每种检测类型的设计指南。

第 4 章 “基因分型实验”

第 5 章 “存在/不存在实验”

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Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System 取扱説明書

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