Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System SDS Software リファレンスガイド

Applied Biosystems

7900HT Fast Real Time PCR System

納品説明補足資料・簡易操作ガイド

Rev.Ｂ

SDS software version 2.3

2

本ガイドはApplied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR Systemの操作を行う際に必要となる部分のみを

記載している簡易操作ガイドです。

詳細は装置付属の英文ユーザーガイドをご確認下さい。また本ガイドには知的財産に関するいかなる情報も含

んでおりません。知的財産に関するする情報は英文ユーザーガイドに記載されておりますのでご参照ください。

研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。

The PCR process and 5' nuclease process are covered by patents owned by Roche

Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche Ltd.

Applied Biosystems, ABI PRISM, GeneAmp, MicroAmp and VIC are registered trademarks

and AB (Design), Applera, FAM, JOE, NED, Primer Express, ROX,TAMRA and TET are

trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other

countries.

TaqMan and AmpErase are registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.

本誌に記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。

記述内容は改良のため予告なく変更される場合がありますので、ご了承下さい。

製品の仕様・外観は改良のため予告なしに変更される場合があります。

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Real - Time 定量 PCR　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

ケミストリ　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・蛍光5’エキソヌクレアーゼアッセイケミストリ（TaqMan®アッセイケミストリ）　　　－－－－－－－－－－

・SYBR®Green ⅠDye アッセイケミストリ　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

7900HT Fast システムの特徴　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・ハードウェア　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・ソフトウェア　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

SDS システムソフトウェア簡易操作ガイド（Ⅰ）

・Absolute Quantification 使用フロー　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・新規プレートドキュメントの作成　（Wizardを使用する場合）　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－

・新規プレートドキュメントの作成　（Wizardを使用しない場合）　　　－－－－－－－－－－－－－－－－

・サーマルサイクリング条件の指定とランの開始　（96 ウェル / 384 ウェル）　　　－－－－－－－－－－－

・サーマルサイクリング条件の指定とランの開始　（Fast 96 ウェル）　　　－－－－－－－－－－－－－－

・サンプルのシール方法　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・プレートのセットとランの開始　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・データ解析　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・解析結果のエクスポート　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・ガイドラインに基づいた反応条件　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

SDS システムソフトウェア簡易操作ガイド（Ⅱ）

Relative Quantification ～RQソフトウェアによる検量線を用いない相対定量～　　　－－－－　

Absolute Quantification ～検量線を用いた定量法～　　　－－－－－－－－－－－－－－－

・比較CT法（DD CT法）とは　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・DD Ct （RQ）ドキュメントを用いた定量実験のワークフロー　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－

・RQ Plate ドキュメントの新規作成　（Wizardを使用する場合）　　　－－－－－－－－－－－－－－－－

・サーマルサイクリング条件の指定とランの開始　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・RQ Manager 1.2 ソフトウェアを用いたRelative Quantification Study　　　－－－－－－－－－－－－

・解析データの確認　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・解析結果のエクスポート　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

SDS システムソフトウェア簡易操作ガイド（Ⅲ）

Allelic Discrimination ～対立遺伝子識別アッセイ～　　　－－－－－－－－－－－－－－－

・Allelic Discrimination アッセイ使用フロー　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

・Ⅰ： Allelic Discrimination ドキュメントの作成とPre-Readの実行（Wizardを使用する場合）　－－－－－

・Ⅱ： Absolute Quantification ドキュメントでのラン（Wizardを使用する場合）　　－－－－－－－－－－－

・Ⅲ： Allelic Discrimination ドキュメントでのPost-Readの実行　　　－－－－－－－－－－－－－－－－

・Ⅳ： Allelic Discrimination ドキュメントでの解析　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

SDS システムソフトウェア簡易操作ガイド（Ⅳ）　　　

装置のメンテナンス　　　－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

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PCR反応理論式

[DNA]n= [DNA]0 (1+e)n

[DNA]n: nサイクル目のPCRプロダクト量

[DNA]0 : ターゲットテンプレートの初期量

e : 平均PCR効率

n : サイクル数

PCR効率を100%と考えると、上の式 e = 1 となるので、

[DNA]n= [DNA]0 ×2n

となり、PCRプロダクトは 1サイクルごとに 2の乗数倍で増える。

サイクル数

（Log表示）

C

CT

T　(Threshold　Cycle）値

指数関数的

増幅領域

21 22 23 24 25 26

20

補助線（Threshold Line）と増幅曲線の交点であるサイクル数（CT値）をみると、 100%のPCR効率が得られた

場合、 2倍の初期濃度の差は1サイクルの差となる。

広い濃度範囲のサンプルを指数関数的領域で比較できるので、より正確な定量結果を得ることができる

PCR (

プラトー

Threshold Line

- Real-Time 定量PCR -

5

- Real-Time 定量PCR -

PCR増幅曲線

サイクル初期

サイクル中期

サイクル後期

PCRプロダクトの対数

　サイクル数　

出番は

まだ～？

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）はDNA鎖を複製する循環的な酵素反応で、前のサイクルで複製されたプロダク

トが連続するサイクルでのテンプレートとして用いられます。それゆえにPCRは目的とする標的配列分子を指

数関数的に増幅させることができます。その増幅効率が100％、すなわち標的配列分子が毎サイクルで2倍

に増幅される場合、20サイクル後には標的分子が100万倍に増幅されることになります。しかし、実際のPCR

効率は100％とはならない場合がほとんどです。

サイクル初期

サイクル初期ー中期ー後期のPCR

6

- Real-Time 定量PCR -

サイクル中期

プラトー効果を引き起こす要因には次のような

ものがあります。

・dNTPとプライマーの加水分解

・DNAポリメラーゼの熱による失活

・一本鎖PCRフラグメントの再会合による

　プライマーアニーリング効率の低下

・PCRプロダクトの蓄積によるDNAポリ　メラー

ゼの有効濃度の低下

・非特異的PCRプロダクトによる競合阻害

・ピロフォスフェートのようなPCR阻害物　の蓄

積

・DNAポリメラーゼの５‘－３’エキソ　ヌクレアー

ゼ活性によるPCRプロダクト　の加水分解

また、プラトーに達するサイクル数は増幅される対象

となるDNA配列によって大きく異なります。増幅され

る配列における長さ（アンプリコン）、GC含量、二次

構造はずべてプラトー効果に寄与する重要な要因と

なります。標的DNAの初期量または初期濃度も同様

です。結局、プラトーに達するサイクル数は各標的配

列毎に実験的に決定しなければなりません。このよ

うにPCRを用いて標的配列分子の定量を行う場合

は初期量とPCRプロダクト量との間に前式のような

関係が成立する指数関数的増幅領域での測定が前

提条件となります（競合PCRは例外です）。

まだかな？

じゃまだヨ～

切っちあゃうぞ

どいて!

手がまわら

ないヨ～

ボクも

お願いネ!!

サイクル後期（プラトー）

プライマーダイマーを含めた非特異的PCRプロダクトの生成を抑制し、標的分子の特異的PCRプ

ロダクトを効率よく増幅させることは反応条件の最適化で可能です。一方、あるサイクル数を過ぎ

ると（一般的にPCRプロダク

トが10-8M濃度に達した時）PCR効率はサイクル数

の増加に伴って低下し、指数関数的な増幅から

直線関数的な増加に変化します。

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注意：最も一般的な「例」を示しています。機種により励起波長のフィルタリング等が異なります

蛍光5´ヌクレアーゼケミストリ（TaqMan®アッセイケミストリ）

TaqMan®プローブの構造は以下の通りになります。

Reporter Quencher

5‘ 3‘

R Q

TaqMan®プローブは両末端を異なる蛍光でラベルした20～30塩基のオリゴヌクレオチドで、ター

ゲット領域に特異的にハイブリダイズするように設計されています。尚、TaqMan®プローブの3‘末

端はリン酸化され、プローブからの伸長反応が起きないようになっています。

5‘末端にはFluoresceine 系の蛍光色素（R:リポーター）、3’末端にはRhodamine 系の蛍光色素

（Q:クエンチャー）をラベルします。

TaqMan®プローブが単体で存在しているとき、リポーターの励起光を照射するとリポーターの蛍光

波長がクエンチャーの励起波長に近似しているため、リポーターの蛍光エネルギーはクエンチャー

の励起エネルギーとして使用され、クエンチャーが蛍光を発します。このためTaqMan®プローブが

単体で存在しているときにはリポーターの蛍光が抑制されます。

リポーター蛍光＝クエンチャー励起光

　　　　　（530-560nm 前後）

リポーター励起光　

　　　（488nm）

クエンチャー蛍光

（580-620nm 前後）

R Q

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NFQ MGB

R

NFQ

MGB

R: Reporter Dye　（FAM　or VIC)

: Non-Fluorescent Quencher　

: Minor Groove Binder

★ MGBの付加によりTmの値が上がり、短く設計できる

★ SNPsタイピングの場合１塩基ミスマッチ率が上がる

★ Quencherの蛍光色が出ないため、バックグラウンド

　ノイズが低くなる

特徴

TaqMan®MGB Probe

TaqMan®プローブについて

TaqMan®

プローブの種類

プローブの特徴

アプライドバイオシステムズではTaqMan®アッセイのためのプローブとして下

記の2種類をご提供しています。

◆　　TaqMan®プローブ

◆　　TaqMan®MGB プローブ

2種類のプローブのそれぞれの特徴は下記の通りになります。　　　

TaqMan®

MGB

TaqMan®

プローブ

Nonfluorescent

quencher Minor groove binder

TAMRATM なし

6-FAMTM

VIC®, or

TETTM

6-FAMTM

VIC®, or

TETTM

5’ ラベル 3’ ラベル特徴

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1. Polymerization

TaqMan®プローブの両端には、リポーター蛍光色素（R）とクエンチャー蛍光

　色素（Q）がそれぞれ5´末端と3´末端に結合している

2. Strand displacement

反応前のTaqMan®プローブは、リポーターから蛍光がクエンチ（消光）されている

3. Cleavage

　　各伸長サイクル中に、DNAポリメラーゼの5´-3´エキソヌクレアーゼ活性により

　　 TaqMan®プローブが分解されリポーター蛍光色素が5´末端から遊離する

4. Polymerization completed

　　リポーター蛍光色素は、クエンチャー蛍光色素と距離が離れて蛍光を発する

R

5´

3´

5´

3´

5´

3´

R

3´5´

3´

5´ 5´

3´

R

3´

5´

3´

5´ 5´

3´

RQ

FORWARD

PRIMER

REVERSE

PRIMER

PROBE

3´

5´

3´

5´ 5´

3´

蛍光5´ヌクレアーゼケミストリ（TaqMan®ケミストリ）

Q

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1. Reaction setup

SYBR®Green I Dyeは、２本鎖DNAに結合することで強い蛍光を発する

2. Denaturation

DNAが１本鎖に変性する時、SYBR®Green I DyeはDNAから遊離し、蛍光は急激に減少する

4. Polymerization completed

　　伸長反応に伴い、 SYBR®Green I Dyeは２本鎖DNAに結合し再び蛍光を発する

　　　増加した蛍光を7900システムが検出する

SYBR®Green I Dye　アッセイケミストリ

3. Polymerization

　　伸長反応中、プライマーがアニーリングしPCR産物が産生される

FORWARD

PRIMER

REVERSE

PRIMER

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SYBR®Green I Dye　アッセイケミストリ

蛍光強度

-解離曲線によるPCRプロダクトの検証-

温度　℃ 温度　℃

蛍光量の１次微分（変化量）

温度　℃

ターゲットのピーク

ターゲット以外のピーク

ターゲットのみのピーク

蛍光量の１次微分（変化量）

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7900システムハードウェア

システム本体解析用PC

Zymark®Twister®

プレートハンドラ

（付属モデルのみ）

蛍光データ回収システム

スキャンヘッドが移動しながらウェル毎に

励起光をあて、蛍光データを回収します。

7～10秒毎に96ウェルまたは384ウェルの

データを回収します。

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光源：Arレーザー励起波長：488nm

7900システムハードウェア

各ウェルの500-660nmの間の蛍光波長を5nm間隔でデータ回収します

96ウェルまたは384ウェルのデータを7～10秒毎に回収します

キャリブレーション用のデータのうち

・Backgroundデータはウェル単位で回収・作成されます

・Pure Dyeデータは行毎に回収・作成されます

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Multicomponent

時間

Raw Data

7900システムソフトウェア

蛍光波長

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増幅曲線

検量線

（増幅効率 e = 10(-1/検量線の傾き)－1）

CT

濃度

サイクル数

Delta

Rn

7900システムソフトウェア

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解離曲線

温度（℃）

Report

（SYBR®アッセイのときのDerivative Data）

7900システムソフトウェア

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SDSシステムソフトウェア簡易操作ガイド(I)

Absolute Quantification

～検量線を用いた定量法～

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PC を起動

7900システムを起動

ソフトウェアの起動ならびにプレートドキュメントの作成 (p.19～)

PC（コンピュータ）と7900システム本体との正常なコミュニケーションをはかるために、

以下の手順でのご使用をお願い致します。

Absolute Quantification　使用フロー

ドキュメントの保存

ランの開始～終了 (p.38～)

データ解析 (p.39～)

・Windows の Desktop 画面になるのを確認

・ステータスライトが緑色の POWER 表示

・Detector と Task の設定

・Thermal Cycler　プロトコールの確認（変更）

・サンプルが分注されたプレートをセット

・Start ボタンをクリックしてランを開始

　ステータスライトが黄色のIN USE点滅表示

・ランの終了 / The run completed successfully 表示

・データ解析、データの Export （タブ区切りファイル）

シャットダウン

・ソフトウェア→7900システム→PC の順番

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新規プレートドキュメントの作成　(Wizardを使用する場合)

1.　デスクトップ上のショートカットをダブルクリックし、SDS Software を起動します。

２． File メニューより、New Plate Wizard を選択します。

３． Create Plate Document Wizard が表示されます。

４

5

４.　Quantification の中から Standard Curve (AQ) を選択します。

５.　 Next をクリックします。

SDSソフトウェア v2.3では、Create Plate Wizard を使用して新規プレートドキュメントを作成することができ

ます。この場合、既存のプレートドキュメントのサンプル情報を利用して設定することも可能です。また

v2.2.2 以前のバージョンと同じ手順で作成することも可能です。その場合はp.25からの手順をご参照くだ

さい。

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６．使用するプレートに応じて Plate Type を選択します。プレートと選択は下記の表の通りです。

７． Blank Document を選択します。

８.　　Next をクリックします。

Plate Type反応するプレートタイプ

384 Wells TaqMan®Low Density ArrayLow Density Array

96 Wells Clear PlateFast 96ウェル

96 Wells Clear Plate96ウェル

384 Wells Clear Plate384ウェル

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