3M Allergen Protein ELISA Kit 取扱説明書

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（日本語）

JA

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発行日： 2017-11

製品情報

カシュープロテインELISAキット

カシューナッツタンパク質の定量分析用酵素結合免疫吸着検査（ELISA）キットです。

製品の概要および用途

3M™ カシュープロテインELISAキットは、定置洗浄水（CIP）の最終洗浄水、環境スワブ検体、食材、加工食品に存在するカシュー

ナッツタンパク質の検出用キットです。

3M カシュープロテインELISAキットはサンドイッチELISAを利用しています。検体中に存在するカシューナッツタンパク質は、ポリ

スチレン製マイクロタイタープレートのウェル表面に吸着された抗カシューナッツ抗体と反応します。洗浄による未結合タンパク

質の除去後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と結合した抗カシューナッツ抗体を添加します。これらの酵素標識抗体は、以

前に結合したカシューナッツタンパク質と複合体を形成します。 2度目の洗浄後、免疫吸着剤に結合した酵素は、発色基質である

3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（TMB）を添加することで検出されます。酵素反応による発色は、検査した検体中のカシューナッ

ツタンパク質の濃度に応じて直接変化します。したがって、450 nmでの吸光度は、検体中のカシューナッツタンパク質の濃度を測

る指標となります。検体中のカシューナッツタンパク質量は、既知の濃度標準から描出した標準曲線から外挿でき、検体希釈を

考慮して調整できます。

3M カシュープロテインELISAキットは、検査技術の訓練を受けた技術者が検査室環境で使用することを想定しています。 3Mは、

食品または飲料以外の産業における本製品の使用に関しては検証しておりません。たとえば、3Mは、本製品を医薬品、化粧品、

臨床または動物診断検体の検査で使用することについて検証しておりません。 3M カシュープロテインELISAキットは、あらゆる

食材、食品製造工程、検査プロトコルについて評価されたわけではありません。

3M カシュープロテインELISAキットは、表1に記載のとおり96検体用となっています。

表1. キットの内容

品目特徴調製

（詳細については「試

薬の調製」セクションを

参照してください）

保管安定性

3M™ カシュープロテイ

ンELISAウェル

除去可能な抗体でコーティング

された96ウェルプレート1枚入り

のホイルバッグ1 個。

調整済みです。乾燥剤を入れ

たホイルバッ

グに密封して2

～8°Cで保管し

てください。

未使用のウェルと乾燥

剤を入れたホイルバッ

グを再度密封してくだ

さい。キットの使用期

限まで安定性を維持す

るには、2～8°Cで保管

してください。

3M™ カシューHRPコン

ジュゲート（10倍）

10倍西洋ワサビペルオキシダー

ゼ（HRP）標識抗体（10倍）1.5

mL入りのバイアル1本。

使用直前に1/10に希釈

して、1倍の希釈標準溶

液を調製してください。

暗所にて2

～8℃で保管し

てください。

10倍コンジュゲートは

キットの使用期限まで

安定性を維持します。

3M™ カシュープロテイ

ン標準濃縮液

既知濃度のカシューナッツタン

パク質濃縮液入りのバイアル

1本。

標準的な調製手順につ

いては、「ELISAの手順」

セクションを参照してく

ださい。

2～8°C。冷凍

しないでくだ

さい。

3M カシュープロテイン

標準濃縮液は、キットの

使用期限まで安定性を

維持します。

3M™ 希釈液（5倍） 5倍希釈液50 mL入りのボトル

1本。

使用直前に1/5に希釈

して、1倍の希釈標準溶

液を調製してください。

2～8°C 5倍の3M 希釈溶液は、

キットの使用期限まで

安定性を維持します。

3

（日本語）

JA

2

3M™ 洗浄液（20倍） 20倍洗浄液50 mL入りのボトル

1本。

1/20に希釈して1倍の

希釈標準溶液を調製し

てください。

1倍希釈標準

溶液と20倍

洗浄液濃縮液

のいずれも2

～8°Cで保管し

てください。

20倍の3M 洗浄液は、キ

ットの使用期限まで安

定性を維持します。

1倍洗浄液は、調製後1

週間以上安定性を維持

します。

3M™ 抽出緩衝液E26

（4倍）

4倍抽出緩衝液120 mL入りの

ボトル 1 本。

1/4に希釈して1倍の

希釈標準溶液を調製

してください。使用前

に、希釈標準溶液を50

～60°Cに加熱してくだ

さい。

1倍希釈標準

溶液と4倍の

3M 抽出緩衝

液のいずれも2

～8°Cで保管し

てください。

1倍抽出緩衝液と4倍の

3M 抽出緩衝液は、キッ

トの使用期限まで安定

性を維持します。

3M™ 発色基質溶液 3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン

（TMB）12 mL入りのボトル1本。

調整済みです。暗所にて2

～8℃で保管し

てください。

直射日光を避けてくだ

さい。 3M 発色基質溶

液は、キットの使用期

限まで安定性を維持し

ます。

3M™ 反応停止液 0.3M硫酸12 mL入りのボトル

1本。

調整済みです。 2～8°C 3M 反応停止液は、キッ

トの使用期限まで安定

性を維持します。

キットに同梱されない器具類：

• 精密ピペットおよびピペットチップ（10～100 L採取用）

• 試験管

• マイクロタイタープレート洗浄機／アスピレーター

• 蒸留水または脱イオン水

• マイクロタイタープレートリーダー

• 試薬および緩衝液調製用の各種実験機器

• タイマー

• 撹拌機

• 振盪水槽または振盪培養器

• オービタルシェーカー

安全性

3M カシュープロテインELISAキットをご使用になる前に、本書に記載されたすべての安全情報をお読みになり、よく理解し遵守し

てください。また、これらの情報は大切に保管してください。

警告：適切な危険予防措置が行われていない場合、死亡または重篤な傷害や、物的損害が発生する可能性があります。

注記：適切な危険予防措置が行われていない場合、危険な状況により物的損害が発生する場合があります。

W 警告

化学物質の曝露に関連する危険を回避するために：

• 現行の行政規制および産業基準に従って廃棄してください。

• 検査実施担当者に現行の適切な検査技術を身につけるように指導してください（例：GLP

1

またはISO/IEC 17025

2

）。

• 試薬を取り扱う際は、適切な保護衣、保護メガネの装着など、標準的な検査室の安全手順に常に従ってください。

• 3M 反応停止液が皮膚に接触しないようにしてください。その他の安全に関する情報は、安全データシートを参照してくださ

い。

汚染物質の放出につながる偽陰性の結果に伴う危険を回避するために：

• 3M カシュープロテインELISAキットは、外装表示および製品情報に記載のとおりに保管してください。

• 3M カシュープロテインELISAキットは、社内または第三者による検証を行った食品検体および環境検体に使用してくださ

い。

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3

• プロトコルに従い、製品情報に記載のとおりに検査を行ってください。

• 3Mは、食品または飲料以外の産業における3M カシュープロテインELISAキットの使用に関しては検証しておりません。

たとえば、3Mは、本製品を医薬品、化粧品、臨床または動物診断検体の検査で使用することについて検証しておりません。

汚染物質の放出につながる不正確な測定結果に伴う危険を回避するために：

• 3M カシュープロテインELISAキットは使用期限までに必ず使用してください。

• 希釈標準液を調製する際は、3M カシュープロテインELISAキットを、必ず20～25°Cで使用してください。

• 3M カシュープロテイン標準濃縮液を冷凍しないでください。

• 発色基質溶液が青く変色している場合は、使用しないでください。 3M 発色基質溶液の交差汚染を回避するため、GLP

1

に従ってください。

注記

不正確な測定結果に伴う危険を回避するために：

• 抽出後検体の安定性は評価されていません。 ELISA手順は、検体の抽出直後に実施する必要があります。

• 検体の交差汚染を回避するため、3M カシュープロテイン標準濃縮液はGLP

1

に従って取り扱ってください。

• その他の情報については製品安全データシートを参照してください。

製品性能に関する資料の詳細をご希望の場合は、当社のWebサイト（www.3M.com/foodsafety）をご覧いただくか、3M販売担

当者またはお近くの販売店までお問い合わせください。

お客様の使用責任

お客様には、使用前に添付文書および製品情報を熟読し、情報に精通する責任があります。詳細につきましては、当社ウェブサイト

www.3M.com/foodsafetyをご覧いただくか、お近くの3M販売担当者または販売店にお問い合わせください。

食品分析で使用されるあらゆる検査方法と同様に、試験マトリックスが結果に影響を及ぼす可能性があります。検査方法を選択

する際には、サンプリング方法、検査プロトコル、サンプルの準備、取り扱い、および検査手技などの外的要因が結果に影響するこ

とを認識することが重要です。食品サンプルそのものが結果に影響することもあります。

十分な数のサンプルを評価して、その検査方法がお客様の基準を満たしていると納得できる検査方法または製品を選択すること

は、お客様の責任となります。

また、その検査方法および結果が顧客あるいは供給業者の要求を満たしているかについても、お客様の判断となります。

どの検査方法を使用した場合でも、3M食品衛生管理製品を使用して得られた結果により、検査で使用した食材または工程中の

品質を保証するものではありません。

保証の制限／限定的救済策

個々の製品パッケージの限定保証条項に明示されている場合を除き、3Mは明示または黙示を問わず、商品性または特定の目的

への適合性に関する保証を含むがこれに限定されない、あらゆる種類の保証も負いかねます。 3M食品衛生部門の製品に欠陥が

あった場合、3Mまたは取扱販売店で交換あるいは返品処理をいたします。対応は上記のみとさせていただきます。製品の欠陥

が疑われる場合は、判明した時点から60日以内にすみやかに3Mに通知し、製品を3Mに返送する必要があります。返品可否につ

いてはカスタマーサービスにお電話にてご連絡いただくか、お近くの3M食品衛生部門までお問い合わせください。

3Mの保証責任範囲

3Mは、直接的・間接的、特殊、偶発的または必然的を問わず、利益損失を含むがこれに限定されないあらゆる損失に対しての責

任を放棄します。いかなる場合においても、あらゆる法的理論に対しても、3Mの保証責任範囲は、欠陥と認められた製品の購入

金額を超えることはありません。

保管と廃棄

3M カシュープロテインELISAキットの内容物は、2～8°Cで保管してください。冷凍しないでください。希釈した希釈標準液は、

表1に記載のとおり保存してください。

3M カシュープロテインELISAキットの内容物が使用期限を過ぎた場合は、使用しないでください。使用期限およびロット番号は

外箱ラベルに記載されています。

現行の行政規制および産業基準に従って廃棄してください。

使用方法

すべての指示に、注意深く従ってください。従わない場合、正確な結果が得られないことがあります。

試薬の調製

使用前に、すべての試薬を周囲温度（20～25°C）に戻してください。清潔な実験機器を使用して希釈標準液を希釈し、保管します。

（日本語）

JA

4

a. 3M 抽出緩衝液

1倍抽出緩衝液を調製するには、3M 抽出緩衝液（4倍）1を添加し、脱イオン水または蒸留水3で希釈します。使用前に、水槽

または振盪培養器で抽出緩衝液（1倍）をあらかじめ50～60°Cに加温してください。各検体につき、1倍抽出緩衝液4.5 mL

が必要です。

b. 3M 希釈溶液

1倍希釈溶液を調製するには、3M 希釈液（5倍）1を、脱イオン水または蒸留水4に添加します。各検体につき、1倍希釈溶液

4.5 mLが必要です。

c. 3M 洗浄液

1倍洗浄液を調製するには、3M 洗浄液（20倍）1を、脱イオン水または蒸留水19に添加します。各3M ELISAウェルにつき、

1倍洗浄液約2.5 mLが必要です。

注： 3M 洗浄液（20倍）を2～8°Cで保存すると、液中に結晶が発生することがあります。洗浄液（1倍）の調製前に、3M 洗浄液

（20倍）を水槽または振盪培養器で30～35°Cに加温してください。

d. 3M カシューHRPコンジュゲート

1倍カシューHRPコンジュゲートを調製するには、3M カシューHRPコンジュゲート（10倍）1を添加し、1倍希釈溶液9で希釈

します。使用直前に調製してください。各3M ELISAウェルにつき、1倍カシューHRPコンジュゲート100 μLが必要です。

検体の準備

注：検体はすべて、あらかじめ50～60°Cに加温した1倍緩衝液で抽出してください。

1.1 表2に記載のとおり、清潔な試験管または使い捨てチューブでタンパク質抽出用検体を調製します。

表2. 検体の準備

検体マトリックス検体量希釈液（1/10）

固形食品 0.5±0.02 g あらかじめ加温した1倍抽出緩衝液4.5±0.09 mLを添加します

液体食品 0.5±0.01 mL あらかじめ加温した1倍抽出緩衝液4.5±0.09 mLを添加します

定置洗浄（CIP）最終洗浄水 0.5±0.01 mL あらかじめ加温した1倍抽出緩衝液4.5±0.09 mLを添加します

固体

液体

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1.2 希釈した検体を、振盪水槽または振盪培養器で50～60°C、25±1分間培養します。別法として、検体を50～60°Cの水槽ま

たは培養器に入れ、5分ごとに1分間手で振盪します。

1.3 培養後、検体を5000～7000 rpm（3000 x g）で20～30秒間遠心分離して微粒子をペレット化するか、試験管ラックで5分間

沈殿させます。

1.4 中間層（水層）から100 μLを採取し、希釈溶液（1倍）900 μLに添加します。撹拌機にかけるか、振盪して十分に混合します

（この検体は原検体の1/100希釈に相当します）。

または

50～60°C

00:25:00

または

3000 g／00:00:30

00:05:00

ELISA手順

2.1 1検体または1標準溶液につき3M ELISAウェルを1つ取り出し、ウェルをウェルホルダーにセットします。未使用の3M ELISA

ウェルをホイルパウチに戻し、再度密封して2～8°Cの保管庫に戻します。

2.2 3M カシュープロテイン標準濃縮液を使用して、希釈溶液（1倍）で希釈した標準溶液を4セット調製します。

標準番号標準濃度

（ng/mL）

1倍希釈液に添加した

標準溶液の容量

1倍希釈溶液の容量

4 243 3M カシュープロテイン

標準濃縮液10 μL

990 μL

3 81 標準溶液4 200 μL 400 μL

2 27 標準溶液3 200 μL 400 μL

1 9 標準溶液2 200 μL 400 μL

0 0 0 400 μL

2.3 各標準溶液100 μLをピペットで3M ELISAウェルに滴下します。

• 標準溶液0（1倍希釈溶液）

• 標準溶液1（9 ng/mL）ppb

• 標準溶液2（27 ng/mL）ppb

• 標準溶液3（81 ng/mL）ppb

• 標準溶液4（243 ng/mL）ppb

2.4 1.4で調製した抽出検体100 μLをピペットで3M ELISAウェルに滴下します。

2.5 3M ELISAウェルを400 rpmに設定したオービタルシェーカーで周囲温度（20～25°C）にて30±2分間培養します。

このステップ中は、ウェルにカバーをかけて水平に保ち、蒸発を防いでください。

（日本語）

JA

6

2.6 培養後、3M ELISAウェルの内容物を吸引します。

2.7 各3M ELISAウェルを1倍洗浄液で完全に満たし、吸引します。手作業で洗浄する場合は、プレートを逆さにして内容物を廃

棄容器に注ぎ入れるか振り落とし、吸収紙上にウェルを叩き付けて、残った洗浄液を落とします。 1回の洗浄につきこの手順

を3回繰り返し、合計4回洗浄します。

2.8 1倍カシューHRPコンジュゲート100 μLをピペットで各3M ELISAウェルに滴下します。 400 rpmに設定したオービタル

シェーカーで、ウェルを周囲温度で10±2分間培養します。このステップ中はプレートにカバーをかけ、暗所で水平に保ちます。

2.9 ステップ2.6と2.7を繰り返し、洗浄液（1倍）で合計4回洗浄します。

2.10 3M 発色基質溶液（TMB）100 μLをピペットで各3M ELISAウェルに滴下します。

2.11 400 rpmに設定したオービタルシェーカーで、ウェルを周囲温度で10分間培養します。このステップ中はプレートにカバー

をかけ、暗所で水平に保ちます。

2.12 培養後、各3M ELISAウェルに3M 反応停止液100 μLを添加し、30分以内に吸光度（450 nm）を測定します。

00:30:00／周囲温度

00:10:00／周囲温度

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7

00:10:00／周囲温度

結果の分析

3.1 各検体の平均バックグラウンド値を差し引きます（検体の平均吸光度－標準溶液0の平均吸光度）。

3.2 4パラメーターロジスティック曲線適合を描出できるコンピューターソフトウェアを用いて、x軸上に濃度をng/mL（ppb）で、

y軸上に対応する各標準溶液の吸光度をプロットすることにより、標準曲線（検量線）を描きます。二次多項式（二次方程式）

や他の曲線適合も使用できますが、データ適合の精度はそれほど正確ではありません。

3.3 検量線から検体濃度を算出します。結果の単位はng/mL（ppb）です。次に、検体の希釈係数を乗じて原検体の濃度を得ま

す。たとえば、検体の総希釈率が1/100であり、検量線の検体濃度が200 ng/mL（ppb）である場合は、最終検体濃度は

200 ng/mL x 100 = 20,000 ng/mL（ppb）、すなわち20 μg/ mL（ppm）となります。

最低性能特性

a. 分析の検出限界（LOD）は2.6 ng/mL（ppb）です

検出限界は、特定の確率水準で真のブランク検体と区別できる検体中に存在するアレルゲンの最低濃度です

3

。標準溶液0

を48回測定した場合の平均光学濃度値に3倍標準偏差（three standard deviations）を加え、対応する濃度を計算するこ

とで算出します。

b. 定量限界（LOQ）は0.9 ppmです

定量限界は、特定の精度で合理的に定量できる検体中に存在するアレルゲンの最低濃度です

3

。

再現性

併行精度（Intra-Assay Precision）平均%CV = <10 N = 12

室内再現精度（Inter-Assay Precision）平均%CV = <10 N = 12

特異性および交差反応性

このアッセイはカシューナッツタンパク質を認識し、交差反応性については各種検体に対し試験が行われました（表3）。

表3. 3M カシュープロテインELISAキットの交差反応性。

食材検体交差反応性（%）

アーモンド粉 <1%

アーモンドミルク <1%

BLG <1%

乳カゼイン <1%

牛乳 <1%

ブラジルナッツ <1%

そば粉 <1%

カシューナッツ

（+）

セロリ <1%

ヒヨコ豆 <1%

ココナッツ粉 <1%

（日本語）

JA

8

ココナッツミルク <1%

コーンフラワー <1%

魚パルブアルブミン <1%

ヘーゼルナッツ <1%

ライマメ <1%

マカダミアナッツ <1%

マスタードシード <1%

オボムコイド <1%

エンドウ豆抽出物 <1%

ピーナッツ粉 <1%

ピーカンナッツ <1%

松の実 <1%

ピスタチオ粉 <1%

カボチャ種子 <1%

ホタテ貝 <1%

ゴマ種子 <1%

エビ <1%

モロコシ粉 <1%

大豆粉 <1%

豆乳 <1%

ヒマワリ種子 <1%

くるみ <1%

参考文献

1. 美国食品药品监督管理局。美国《联邦规章典集》(Code of Federal Regulations) 第 21 篇，第 58 部分。非临床优良实验

室研究规范。

2. ISO/IEC 17025。用于检验和定标实验室能力的一般要求。

3. Abbott, M.、Hayward, S.、Ross, W.、Godefroy, S.B.、Ulberth, F.、Van Hengel, A. J.、Roberts, J.、Akiyama, H.、Popping,

B.、Yeung, J.M.、Wehling, P.、Taylor, S.、Poms, R.E. 和 Delahaut, P（. 2010 年）。附录 M：定量食物过敏原 ELISA 方法的

验证程序：社区指导和最佳做法。

J. AOAC Int.

93, 442-450

記号の説明

www.3M.com/foodsafety/symbols

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3M Allergen Protein ELISA Kit 取扱説明書

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